五彩石竹綠化

研究了培養(yǎng)基組成成分對中國石竹品種Diana F1 White組培程序中種子萌發(fā)、誘芽增殖、試管苗玻璃化及生根等重要環(huán)節(jié)的影響。結(jié)果表明:(1)種子適宜的萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS,在此培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率為83.33%,播種后30d時無菌苗高度達(dá)6.99cm,葉片數(shù)達(dá)26.7。(2)在芽誘導(dǎo)階段玻璃化苗發(fā)生率最高可達(dá)53.85%。將光照強(qiáng)度提高至2000lx后,采用培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L+瓊脂8.0g/L+蔗糖8.0g/L進(jìn)行誘芽培養(yǎng),玻璃化苗發(fā)生率降至3.33%,外植體出芽率達(dá)到90%,單個外植體出芽數(shù)達(dá)到7.2個。(3)適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/LIBA+瓊脂8g/L+蔗糖40g/L,培養(yǎng)30d時生根率為100%,平均根條數(shù)達(dá)到24.7條,平均根長度達(dá)到4.7cm。試管苗在消毒后的腐殖土中移栽,成活率達(dá)95%。該研究結(jié)果為DianaF1試管苗的快速繁殖提供科學(xué)依據(jù)。

香石竹（Dianthus caryophyfllus L.）為石竹科石竹屬常綠亞灌木花卉,是世界著名的切花之一,其栽培種及野生種的資源有效保存對香石竹的國產(chǎn)化至關(guān)重要。超低溫保存（-196℃）是無性繁殖的植物種質(zhì)資源最安全經(jīng)濟(jì)的保存方法。超低溫保存方法中常用的為玻璃化法,近年來在傳統(tǒng)玻璃化法上發(fā)展出來小液滴法,即將植物材料經(jīng)玻璃化處理后,在鋁箔上滴成小液滴,后直接投入液氮進(jìn)行迅速冷凍。由于凍存及解凍速度快,組織不易形成冰晶,易成活再生,是一有發(fā)展前景的方法。超低溫保存中,莖尖大小及結(jié)構(gòu)的完整性對超低溫保存的成活率及恢復(fù)培養(yǎng)均有影響。我們以香石竹為模式植物,結(jié)合包埋法及小液滴法的特點(diǎn),對相關(guān)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),探索一種適用于植物莖尖超低溫保存方法及冷凍植株后再生的技術(shù)。試材為香石竹紅花品種,從上?；ɑ苁袌鲑徺I。切取花莖繁殖試管苗,獲得花莖無性繁殖系。取組培繼代3個月以上的無菌組培苗。莖尖超低溫保存的試驗(yàn)方法為：1、常規(guī)玻璃化法：（1）剝?nèi)?～2mm無菌苗莖尖,接種到含0.3 mol·L-1蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基中,在25℃下培養(yǎng)1～3d;（2）經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后,將莖尖置于含預(yù)處理液（含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液）的2ml冷凍管中,于室溫下處理60min,然后將預(yù)處理液吸出,換入預(yù)冷玻璃化保護(hù)劑PVS2中在冰浴中處理60～120min;（3）冷凍管換入預(yù)冷新鮮PVS2約0.5ml,迅速投入液氮中保存。解凍取出在液氮中凍存1 h以上的冷凍管,立即放入40℃水浴中快速解凍2 min。（4）莖尖在室溫下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌2～3次,每次5～10 min。（5）洗滌后的莖尖在濾紙上吸干后,轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng),等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中常光培養(yǎng)。2、小液滴法：步驟（1）、（2）同常規(guī)玻璃化法;（3）在凍存前5min將含有1個莖尖的液滴（約5ul）滴在5mm×20mm的無菌鋁箔條上,每個鋁箔條含5個莖尖,將含液滴的鋁箔條直接投入裝滿液氮的安培管中。（4）解凍時直接將含液滴的鋁箔條投入洗滌液中進(jìn)行解凍20 min。步驟（5）同上。3、改良小液滴法：（1）剝?nèi)?～2mm無菌苗莖尖,浸入2%的無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸,即用鑷子將莖尖輕放在3mm×20mm無菌濾紙小條上,每個濾紙條上放5～10個莖尖;（2）將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中,經(jīng)10min固定,在無菌濾紙上吸干多余液體;（3）將帶有莖尖的濾紙小條放入0.3 mol·L-1蔗糖的MS液體或固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1～3d;（4）經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后,將帶有莖尖的濾紙小條置于預(yù)處理液（含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液）中于室溫下處理60min,然后轉(zhuǎn)入玻璃化保護(hù)劑PVS2中在冰浴中處理60～120min;（5）將帶有莖尖的濾紙小條直接投入液氮中,長期保存可轉(zhuǎn)移至無菌冷凍管;（6）解凍時將帶有莖尖的濾紙小條由管中拿出后迅速放入含1.2 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20min;（7）將帶莖尖的濾紙條在無菌濾紙上吸干后放入恢復(fù)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后莖尖可直接生長成植株。結(jié)果表明：3種玻璃化法凍存的香石竹莖尖成活率及再生率均可達(dá)80%。其中小液滴玻璃化法在優(yōu)化程序下進(jìn)行凍存,最高存活率可達(dá)95%,高于常規(guī)玻璃化法（82%）及改良小液滴玻璃化法（87%）?；謴?fù)培養(yǎng)時,最快1d即可見莖尖萌動,再生時間較常規(guī)玻璃化法要短3～5d,但再生率不穩(wěn)定（60%～100%）,易形成愈傷組織及玻璃化苗。改良小液滴法成活率（80%～90%）略高于常規(guī)玻璃化法,再生時間與常規(guī)玻璃化法相同（7～13d）,植株再生率均在80%以上且植株生長健壯一致。改良小液滴法結(jié)合包埋法及小液滴法的特點(diǎn),并采用濾紙小條為操作載體,以批量處理莖尖以提高操作效率,減少在操作過程中機(jī)械損傷,從而達(dá)到穩(wěn)定的成活率及再生率,受操作者水平影響較小,可用于種質(zhì)庫批量化植物莖尖資源超低溫保存。