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更新時間：2025.05.17
代謝工程改造Escherichia coli生產(chǎn)L-蘋果酸

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為了高效生產(chǎn)L-蘋果酸,首先在大腸桿菌w3110中敲除ldh A、pox B、pfl B和pta-ack A基因積累丙酮酸,為L-蘋果酸合成提供前體,并且通過蘋果酸酶的引入構(gòu)建L-蘋果酸一步合成路徑,將丙酮酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸.在此基礎(chǔ)上,敲除frd BC、fum B和fum AC阻斷L-蘋果酸代謝路徑,并結(jié)合pos5基因的表達(dá)對胞內(nèi)輔因子路徑進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明:(1)ldh A、pox B、pfl B和pta-ack A基因的敲除能有效地提高丙酮酸產(chǎn)量到20.9 g/L;(2)蘋果酸酶突變及過量表達(dá)使得L-蘋果酸和琥珀酸產(chǎn)量分別提高了87.2%和31.6%,達(dá)到1.46 g/L和3.25 g/L;(3)通過敲除frd BC、fum B和fum AC,L-蘋果酸產(chǎn)量增加到3.42 g/L;(4)pos5基因的表達(dá)降低了胞內(nèi)NADH/NAD+比率,增加了NADPH含量,最終突變菌株Escherichia coli F0921的L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到9.34 g/L.因此,通過蘋果酸酶構(gòu)建L-蘋果酸生物合成路徑提高L-蘋果酸的生產(chǎn)是可行的,結(jié)果可為代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)L-蘋果酸提供了新的研究思路.

代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)L-蘋果酸

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為了研究胞質(zhì)還原路徑對釀酒酵母積累L-蘋果酸的影響,通過在釀酒酵母中過量表達(dá)源于黃曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、蘋果酸脫氫酶(Afmdh)及C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Afmae),成功構(gòu)建了L-蘋果酸合成的胞質(zhì)還原路徑。結(jié)果表明:(1)當(dāng)?shù)退奖磉_(dá)Afpyc時,其丙酮酸濃度降低了42%,但不能積累L-蘋果酸；(2)當(dāng)共表達(dá)Afpyc和Afmdh時,菌株W005積累了1.93 g/L的L-蘋果酸,與對照菌株W004相比細(xì)胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%；(3)當(dāng)共表達(dá)Afpyc、Afmdh和Afmae時,菌株W006的L-蘋果酸產(chǎn)量提高了21.2%,達(dá)到2.34 g/L；4)通過提高接種量至初始OD_(600)=2,L-蘋果酸的產(chǎn)量提高到3.28 g/L。通過在釀酒酵母中過量表達(dá)黃曲霉胞質(zhì)還原路徑的關(guān)鍵基因,使得工程菌能夠積累L-蘋果酸,為目標(biāo)產(chǎn)物的高效積累提供了一種可借鑒的思路。

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