PLGA型膠原復合支架用于組織工程化骨再造的研究

以冷凍干燥和納米合成技術(shù)制備生物玻璃和膠原復合支架材料,采用掃描電鏡觀察、紅外光譜分析、差示掃描量熱分析、熱重分析、彎曲強度測試等分析手段,對復合支架的理化性能進行研究。研究結(jié)果表明:制備的支架具有多孔結(jié)構(gòu)。在制備過程中,兩相間產(chǎn)生了化學鍵合作用。由此論證了復合支架的孔隙結(jié)構(gòu)可為細胞生長及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生提供充分的空間。兩相間的鍵合作用對于提高骨支架材料的熱穩(wěn)定性能、力學性能,減弱植入體內(nèi)后在體液中的膨脹和浸析反應具有至關(guān)重要的作用。

目的本實驗根據(jù)不同材料的生物學及力學性能,設(shè)計研制出合適的復合膠原蛋白生物支架。為臨床中應用組織工程學方法修復關(guān)節(jié)軟骨損傷提供相應的理論依據(jù)及一定實驗基礎(chǔ)。方法1.ⅰ型膠原蛋白、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鈉等為主材料,制作復合膜,并冷凍干燥后化學交聯(lián)等制作一種復合蛋白結(jié)構(gòu)的生物材料。2.進行理化性能的研究以及細胞毒實驗。結(jié)果所制備的復合材料的抗拉強度檢測顯示:平均可達到5.17×106帕斯卡;酸堿度檢測:樣品ph值與對照組差值均小于1.5;復合材料平均溶脹率=94.0%(n=3);孔隙率平均為80%以上;細胞毒性實驗顯示細胞毒性碳二亞胺小于戊二醛。結(jié)論復合材料理化指標結(jié)果符合體內(nèi)植入物要求,該可以作為組織工程研究中的一種支架材料。

目的依據(jù)仿生原理制備納米骨框架材料。方法以膠原分子為模板,調(diào)制鈣磷鹽在液相中沉積其上,得到礦化膠原基復合材料,并采用液相分離法與少量聚乳酸復合進一步制備成為三維多孔框架材料。分離成骨細胞并在三維框架材料上培養(yǎng),用x-ray、衍射掃描電鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡進行觀察和分析。結(jié)果膠原基納米晶鈣磷鹽復合材料的晶粒度較低,晶體極為細小,與天然骨類似;材料為多孔狀,孔隙率較高;內(nèi)部為典型的纖維束狀結(jié)構(gòu),該纖維束有ha晶體的衍射圖樣,且具有犤002犦擇優(yōu)取向;成骨細胞可在其上貼附、生長和繁殖。結(jié)論仿生制備的三維膠原基納米骨框架材料,無論從結(jié)構(gòu)還是性能上,都是骨組織工程中的優(yōu)選材料之一。

背景:研究證實,殼聚糖及其衍生物可作為骨損傷的填充材料以及骨組織工程支架材料,但殼聚糖降解緩慢且不可控制的特性限制了其在骨組織工程中廣泛應用。目的:評估羧甲基殼聚糖/納米膠原纖維復合支架對兔腓骨損傷的修復作用。設(shè)計、時間及地點:隨機分組設(shè)計、對照動物實驗,于2007-06/2008-03在清華大學生物科學與技術(shù)系生物膜與膜生物工程國家重點實驗室完成。材料:以羧甲基殼聚糖和納米膠原纖維為基礎(chǔ)材料,模擬骨的結(jié)構(gòu)設(shè)計制備了雙層羧甲基殼聚糖/納米膠原纖維復合支架。方法:選擇成年新西蘭大白兔10只,按隨機數(shù)字表法分為3組,陰性對照組2只,殼聚糖支架組4只,復合支架組4只。制備兔腓骨10mm的損傷,分別以曠置縫合、植入殼聚糖支架、植入雙層羧甲基殼聚糖/納米膠原纖維復合支架處理各組。主要觀察指標:掃描電鏡觀察支架微觀形貌。術(shù)后12周,檢測損傷部位的再生情況,以四環(huán)素熒光和vonkossa染色檢測實驗動物骨損傷部位新生骨鈣化情況。結(jié)果:10只兔均進入結(jié)果分析。①掃描電鏡觀察到外層致密光滑的殼聚糖膜和多孔的中心區(qū)域,多孔區(qū)域有大量納米膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)填充。其孔徑分布的峰值為60～100μm,孔隙率大于85%。②手術(shù)后12周,不脫鈣切片的四環(huán)素染色,可發(fā)現(xiàn)陰性對照組兩個斷端間還沒有連上,依舊以游離端存在。復合支架組移植物中形成多個大的鈣化島,其中心網(wǎng)狀材料已經(jīng)大部分降解,鈣化島分布在整個支架的內(nèi)部區(qū)域;而殼聚糖支架組,材料基本沒有降解,未見鈣化區(qū)域。③vonkossa銀染色顯示,復合支架組動物骨損傷的中心區(qū)域,出現(xiàn)染成黑色的鈣化區(qū),中間夾雜著中性紅復染的骨組織細胞。殼聚糖支架組動物沒有明顯的鈣化區(qū),多為組織細胞充斥在材料的孔隙中,可見材料基本沒有降解。結(jié)論:雙層羧甲基殼聚糖/納米膠原纖維復合支架植入動物體內(nèi)12周后,未見明顯的炎癥反應和壞死,降解明顯,能夠促進骨修復,是很有前景的骨組織工程用支架材料。

納米羥基磷灰石（nhap）是一種性能優(yōu)良的骨修復材料,但由于其脆性大、強度低而限制了它在承力部位的應用。nhap與其他材料復合可以提高材料生物相容性和力學性能,具有更大的臨床應用前景?，F(xiàn)就各種nhap復合支架的種類,以及nhap復合材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓間充質(zhì)干細胞復合來構(gòu)建組織工程化骨的研究現(xiàn)狀進行簡要綜述。

軟骨的修復是當前醫(yī)學界十分棘手的難題,人們采取若干手段均收效甚微。由于軟骨缺損時,其下的軟骨下骨常出現(xiàn)硬化、退變,而新生軟骨是無法與病變的軟骨下骨進行整合的,所以在修復軟骨的同時,必須重視軟骨下骨的修復。近十幾年來,人們開始發(fā)明和利用各種骨軟骨復合支架,進行同時修復軟骨與軟骨下骨的動物實驗研究。在正常骨軟骨組織中,軟骨與軟骨下骨被鈣化層所相連,此外鈣化層也將軟骨與軟骨下骨分隔在不同的生存環(huán)境中。根據(jù)仿生學原理,人們又設(shè)計出一種帶有隔離層的新型骨軟骨復合支架,并取得了較為理想的實驗結(jié)果。本文就國內(nèi)外骨軟骨復合支架的研究進展作一綜述。

目的比較復合不同劑量血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的納米羥基磷灰石/膠原蛋白復合骨(nhac)修復骨缺損的效果。方法將納米羥基磷灰石粉末和膠原蛋白粉末按8∶2的比例混合制備nhac人工骨,再將混合粉末與含10ng、100ng、300ngvegf的蒸餾水按1∶1.8的質(zhì)量比調(diào)和制備nhac/vegf人工骨。建立大鼠雙側(cè)橈骨0.5cm缺損動物模型30只,按隨機原則分為5組。以nhac/10ngvegf、nhac/100ngvegf、nhac/300ngvegf人工骨植入骨缺損處進行修復作為實驗組,以nhac人工骨植入組及空白組作為對照組。術(shù)后2、4、8周各組行組織學及免疫組織化學檢查,觀察材料早期血管化及成骨情況。結(jié)果各時間點組織學評分以及血管計數(shù)均為nhac/300ngvegf人工骨組最高,于其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義。各實驗組血管數(shù)量在4周時達到高峰,而nhac組血管數(shù)量在8周時最多。結(jié)論血管內(nèi)皮生長因子能明顯促進nhac早期血管化及新骨形成,比單純應用nhac能更好的修復骨缺損,并且隨著vegf劑量的增加,新生血管數(shù)量和新骨形成量均相應增加。

目的在體外模擬微重力條件下構(gòu)建心肌細胞-膠原復合體,探索組織工程化心肌組織體外再造的可行性。方法采用順序消化及差速貼壁法從1～2d齡新生大鼠的心肌組織中分離心肌細胞,并將其與多孔膠原復合形成復合體。復合體在旋轉(zhuǎn)生物反應器(rotarycellculturesystem,rccs)中進行培養(yǎng),觀測復合體內(nèi)心肌細胞的生長狀況、超微結(jié)構(gòu)、細胞代謝率及細胞組分的變化,并將其與正常心肌和常規(guī)培養(yǎng)的復合體進行比較。結(jié)果在rccs中培養(yǎng)的復合體內(nèi)的細胞具有心肌細胞的特殊超微結(jié)構(gòu),免疫組化顯示其中的α-橫紋肌肌動蛋白染色呈強陽性,與靜止培養(yǎng)的復合體細胞相比,細胞代謝更加旺盛。結(jié)論采用組織工程技術(shù)可以在rccs中培育出組織工程化心肌組織。

關(guān)節(jié)軟骨的解剖結(jié)構(gòu)比較特殊,極易引起損傷。同時,組織修復能力較差。怎樣對關(guān)節(jié)軟骨缺損進行修復,這是骨科長期以來的研究熱點之一。在修復領(lǐng)域,學者大多通過組織工程方法模擬某種損傷結(jié)構(gòu)。本研究將探討新型生物支架材料一包埋載生長因子納米微球的醫(yī)用聚氨酯/脫細胞軟骨支架與骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞(bmscs)復合后修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。1材料與方法1.1組織工程化骨的制備:(1)骨髓間充質(zhì)干細胞:運用密度梯

以飽和ca(oh)2上清液、磷酸和膠原蛋白為原料,在36～39℃、ph=8～9條件下,用共滴定法制備納米羥基磷灰石/膠原蛋白復合支架材料。用xrd、sem、tem、ir對材料的晶相結(jié)構(gòu)、結(jié)晶程度、化學鍵結(jié)構(gòu)、微觀形貌、晶粒大小進行分析。結(jié)果表明:復合材料由低結(jié)晶度的納米羥基磷灰石(5nm×60nm～20nm×100nm)和膠原蛋白纖維組成,二者之間形成了緊密鍵合。

中國組織工程研究第20卷第16期2016–04–15出版 chinesejournaloftissueengineeringresearchapril15,2016vol.20,no.16 p.o.box10002,shenyang110180www.crter.org2412 ·研究原著· www.crter.org 莊穎，男，1979年生， 貴州省凱里人，侗族， 2011年解放軍第三軍醫(yī) 大學畢業(yè)，博士，主治醫(yī) 師，主要從事脊柱相關(guān)疾 病的基礎(chǔ)及臨床研究。 通訊作者：徐永清，教授， 博士生導師，解放軍成都 軍區(qū)昆明總醫(yī)院全軍骨 科中心/干細胞與組織器 官工程研究中心，云南省 昆明市650032 中圖分類號:r318 文獻標識碼:a 文章編號:2095-4344 (2016)16-02412-06 稿件接受

支架的研究一直是骨組織工程研究的主要問題之一。到目前為止已經(jīng)開發(fā)出了不少比較成熟的支架制作技術(shù)。但是這些技術(shù)都還存在一定的缺陷。快速成形技術(shù)由于具有快速性和高度柔性的突出優(yōu)點,因而在支架制造方面具有廣泛的應用前景。清華大學已經(jīng)在這個方面進行了大量的基礎(chǔ)性研究。

背景:臨床試驗證明納米晶膠原基骨支架材料具有較好的組織相容性、合適的孔隙率及降解性能,但缺乏緩釋生長因子的作用,且無成骨誘導性。目的:將聚乙稀吡咯啉酮與骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合后形成復合顆粒,再修飾納米晶膠原基骨制備復合支架,觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白的體外緩釋效果。方法:實驗分3組,實驗組取凍存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm納米晶膠原基骨1塊,滴加聚乙稀吡咯啉酮混勻,-4℃凍存過夜,再滴加骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液,真空抽干后凍存;對照組1取凍存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm納米晶膠原基骨1塊,滴加骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液,真空抽干后凍存;對照組2取凍存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm未脫鈣的大鼠松質(zhì)骨1塊,滴加聚乙稀吡咯啉酮混勻,-4℃凍存過夜,再滴加骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液,真空抽干后凍存。觀察14d,采用elisa法檢測3組復合物骨形態(tài)發(fā)生蛋白的體外釋放活性。結(jié)果與結(jié)論:觀察到14d時,兩對照組骨形態(tài)發(fā)生蛋白a值趨近于0,而實驗組上清液中骨形態(tài)發(fā)生蛋白仍保持較高的a值,組間比較差異有顯著性意義(p<0.05)。表明經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮修飾后納米晶膠原基骨支架具有明顯緩釋骨形態(tài)發(fā)生蛋白的作用。

將介孔生物活性玻璃(mbg)與脫鈣骨(db)復合,利用浸漬法制備出mbg/db復合支架材料.采用紅外光譜(ftir),掃描電鏡(sem),x射線衍射(xrd),電子萬能材料試驗機等方法對牛松質(zhì)骨(cb)、db、mbg/db復合支架進行表征.結(jié)果表明,cb經(jīng)浸酸處理后制備的db,孔徑大小在200～600μm范圍內(nèi),孔隙率約為71%,抗壓性能比cb明顯降低(1.10±0.31)mpa,而采用浸漬法制備的復合支架,孔隙率降為40%左右,而壓縮強度明顯提高(8.49±2.14)mpa.體外生物活性測試表明:復合支架具有良好的生物活性.

幾種骨組織工程復合支架材料在模擬生理溶液中的生物礦化性能比較

通過體外模擬天然骨生物礦化和材料自組裝的形成機制,研究制備了類骨羥基磷灰石/膠原仿生復合材料并對材料進行了表征。結(jié)果表明:納米羥基磷灰石均勻分布在膠原基質(zhì)上并擇優(yōu)取向排列,該復合材料的成分和微觀結(jié)構(gòu)與天然骨類似。

背景:在口腔組織工程學中,由于頜面骨形態(tài)復雜,不規(guī)則,而且頜骨支撐著顏面部,與容貌有很大的關(guān)聯(lián)。這就提出了更高要求,不但要恢復功能而且要恢復原有形態(tài),而且精密的修復形態(tài)將成為今后發(fā)展的趨勢。目的:探討透明質(zhì)酸鈉與復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導兔骨髓基質(zhì)干細胞體外構(gòu)建組織工程化骨修復上頜骨牙槽嵴缺損,并覆蓋個性化鈦模板作為外支架維持新骨塑形的可能性。方法:體外培兔骨髓基質(zhì)干細胞,進行成骨誘導,復合透明質(zhì)酸鈉、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2構(gòu)建組織工程化骨,植入自體牙槽嵴缺損處,外加個性化鈦模板,術(shù)后4,8,12周處死動物分別進行x射線、常規(guī)組織學檢查,觀測組織工程化骨在體內(nèi)成骨作用。以缺損區(qū)植入回收自體骨屑者為對照組。結(jié)果與結(jié)論:術(shù)后第4周,實驗組與對照組新生骨灰度值差異有顯著性意義(p0.05),術(shù)后4周與術(shù)后8周,術(shù)后8周與術(shù)后12周新生骨灰度值存在顯著性差異(p<0.05)。常規(guī)組織學染色顯示,在術(shù)后4周時,實驗組成骨作用遜色于對照組。當生長到第8周時,兩組成骨基本無顯著差異。說明此法構(gòu)建的組織工程化骨在體內(nèi)成骨效應顯著,個性化鈦模板起到屏障塑形作用,促進新骨按特定形狀生成。

目的探討雙層殼聚糖(chitosan,cs)/hap復合支架作為骨軟骨組織工程支架的可行性,并結(jié)合兔自體bmscs修復骨軟骨缺損。方法采用凍干法和燒結(jié)法制作雙層cs/hap復合支架,檢測其理化特性。取日本大耳白兔骨髓4～6ml,全骨髓培養(yǎng)法分離純化bmscs,并鑒定。調(diào)整第2代bmscs細胞密度為2×107個/ml,應用纖維蛋白膠種植技術(shù),接種至雙層cs/hap復合支架,體外構(gòu)建細胞-支架復合物。取36只日本大耳白兔,于右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨下端外側(cè)髁負重區(qū),作一直徑4mm、深3mm的圓柱形缺損,制備兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型。根據(jù)缺損區(qū)植入物的不同,分為a、b、c3組(n=12)。a組:植入細胞-支架復合物;b組:植入雙層cs/hap復合支架;c組:不植入任何材料,作為空白對照組。術(shù)后6、12周取材,行大體及組織學觀察,采用改良wakitani法評分。結(jié)果雙層cs/hap支架cs層孔隙率為76.00%±5.01%,孔徑為200～400μm,平均300μm,孔洞相通;hap層孔隙率為72.00%±4.23%,孔徑為200～500μm,平均350μm,孔洞相通,結(jié)合部結(jié)合好。全骨髓法培養(yǎng)bmscs,第7天可見集落形成,14d傳代;免疫組織化學檢測示cd44(+)和cd45(—)。大體觀察和組織學檢測顯示,a組基本修復軟骨缺損,骨缺損修復不良,有骨小梁長入;b、c組骨、軟骨缺損修復不良,組織學檢測以纖維組織或無新生組織形成,軟骨及骨缺損均明顯存在。術(shù)后6、12周,a組改良wakitani評分分別為(5.17±1.17)分和(3.20±0.75)分,均優(yōu)于b、c組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。結(jié)論雙層cs/hap復合支架可作為骨軟骨組織工程支架,復合bmscs可修復兔關(guān)節(jié)軟骨與骨缺損,重建關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)。

羥基磷灰石(ha)是骨組織中無機物的主要成分。利用絲膠蛋白(ss)良好的生物相容性、生物降解性、細胞相容性,以及含有的羧基和羥基能與ca2+緊密結(jié)合的特點,將氫氧化鈣和磷酸以濕法合成的羥基磷灰石按一定的比例加入到濃縮后的絲膠蛋白溶液中,經(jīng)冷凍干燥制備成絲膠蛋白/羥基磷灰石復合支架材料,期望用于骨替代和骨缺損修復。對絲膠蛋白/羥基磷灰石復合支架材料進行掃描電鏡(sem)、x射線衍射(xrd)、紅外吸收光譜(ftir)、熱力學性能以及力學性能等檢測,并探討不同原料配比對材料結(jié)構(gòu)與性能的影響。結(jié)果表明,絲膠蛋白/羥基磷灰石復合支架材料的孔隙分散均勻,孔隙率33.0%～62.5%;支架材料中的ha呈弱結(jié)晶態(tài),與人體骨組織中ha的晶體態(tài)相似,絲膠蛋白分子呈β折疊結(jié)構(gòu);隨著復合支架材料中ha的比例不斷增加,材料的熱分解溫度提高,熱學性能改善,當ha的質(zhì)量分數(shù)達到50%時,彈性模量增大到15.64mpa,呈現(xiàn)較好的結(jié)構(gòu)性能。

目的關(guān)節(jié)軟骨的病變常伴有軟骨下骨缺損,其修復重建一直是骨科難題。探討bmscs-雙相支架復合物修復骨軟骨缺損的可行性,比較其與植入單純雙相支架及動物自身修復效果的差別具有重要意義。方法以聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolicacid,plga)、羥基磷灰石(hydroxyapatite,ha)為原料制備由軟骨相和骨相構(gòu)成的三維支架,提取天然ⅰ型膠原(collagentypeⅰ,colⅰ)涂于表面制成plga-ha-colⅰ雙相支架。取新西蘭乳兔骨髓分離培養(yǎng)獲得的第2代bmscs,以1×106個/ml接種于雙相支架,掃描電鏡觀察支架結(jié)構(gòu)和細胞分布。取30只6月齡新西蘭大白兔,建立股骨遠端關(guān)節(jié)面骨軟骨缺損模型,隨機均分為3組,a、b組分別于缺損區(qū)植入單純雙相支架和bmscs-雙相支架復合物,c組作為空白對照組未植入支架材料。于術(shù)后1、3、6、9個月取材行大體及組織學觀察,術(shù)后9個月對a、b組標本行大體評分比較、microct掃描定量分析及免疫組織化學染色觀察。結(jié)果掃描電鏡示雙相支架孔隙連通性好,軟骨相和骨相孔徑不同,bmscs在雙相支架內(nèi)生長良好。大體觀察示術(shù)后9個月內(nèi)a組關(guān)節(jié)表面逐漸形成類軟骨樣組織,部分出現(xiàn)塌陷或不規(guī)則缺損;b組關(guān)節(jié)面無塌陷或碎裂,新生組織質(zhì)地更接近正常組織;c組缺損一直存在。大體評分顯示3組修復效果比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。組織學觀察示術(shù)后1個月a、b組缺損區(qū)存在炎性反應;術(shù)后3個月新生組織長入;術(shù)后6個月支架完全降解,新生組織在植入物及缺損邊緣爬行生長;術(shù)后9個月形成大量膠原纖維,表面多為纖維軟骨。c組觀察期內(nèi)缺損持續(xù)存在。術(shù)后9個月免疫組織化學染色示a、b組標本缺損區(qū)colⅱ染色呈弱陽性,colⅰ染色陽性。結(jié)論plga-ha-colⅰ雙相支架具備較適宜的一體化修復骨軟骨缺損的物理特性,接種bmscs后整體修復效果更好。

目的制備和綜合評價組織工程化骨替代材料并用于修復骨腫瘤所導致的骨缺損。方法制備狗和人的異體脫鈣骨基質(zhì)顆粒(dbm),提取牛骨形成蛋白(bbmp)并經(jīng)成骨誘導活性測定,將bbmp與dbm用直接摻和的方法復合后,再與骨水泥(bc)混合制成組織工程化復合材料,進行綜合評價后備用。56例下肢骨腫瘤患者在微波誘導高溫原位滅活后,應用組織工程化復合材料對遺留的骨缺損進行修復重建。結(jié)果bbmp、dbm和bc組織工程化復合骨修復替代材料具有良好的生物相容性、很強的生物力學強度和成骨誘導活性,并且具有良好的粘合性和可塑形性。臨床應用56例,經(jīng)平均9個月的隨訪,效果良好且無任何不良反應?；贾リP(guān)節(jié)功能評價,優(yōu)52例(93%),良4例(7%),優(yōu)良率100%。結(jié)論bbmp、dbm和bc組織工程化復合骨修復替代材料是目前修復骨缺損理想的產(chǎn)品,有廣闊的臨床應用前景。

進行了三維多孔立體結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/聚氨酯(ha/pu)復合支架材料體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)肌肉埋植實驗研究,評估材料的生物相容性。實驗選用sd大鼠的骨髓基質(zhì)干細胞(bmscs)和健康的sd雌性大鼠,進行細胞相容性、形態(tài)學觀察和組織學切片分析。ha/pu支架材料的多孔性為細胞的生長提供了良好的微環(huán)境,細胞在內(nèi)部貼壁爬行、增殖并分化,細胞毒性為零級,材料與周圍組織有良好的結(jié)合,降解的空間有結(jié)締組織纖維長入。實驗表明,ha/pu復合支架材料具有良好的細胞親和性和組織學相容性,可作為一類新型組織工程支架材料。