絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的制備及性能

為了改善羥基磷灰石(hap)的脆性和新骨誘導(dǎo)性,采用共沉淀法合成hap,鹽溶法制備絲素蛋白(sf),在膠體狀態(tài)下將hap和sf復(fù)合得到了sf/hap復(fù)合材料。采用掃描電鏡(sem)、x射線(xiàn)衍射(xrd),傅立葉紅外光譜(fir)對(duì)復(fù)合材料結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行了分析,在模擬體液中檢驗(yàn)了復(fù)合材料的生物活性,并對(duì)其抗壓強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明:hap與sf在納米尺度進(jìn)行了復(fù)合,復(fù)合材料中sf主要以β-折疊構(gòu)象存在,酰胺ⅴ紅外特征峰消失,β-折疊構(gòu)象的其他峰發(fā)生了移動(dòng),表明hap與sf間存在化學(xué)結(jié)合;模擬體液中浸泡18天后,復(fù)合材料表面形成了片層狀的hap;與純的hap晶體比較,復(fù)合材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,具有較好生物活性和骨誘導(dǎo)性,其抗壓強(qiáng)度可達(dá)63mpa,可望成為理想的骨組織替換和工程支架材料。

以飽和ca(oh)2上清液、磷酸和膠原蛋白為原料,在36～39℃、ph=8～9條件下,用共滴定法制備納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合支架材料。用xrd、sem、tem、ir對(duì)材料的晶相結(jié)構(gòu)、結(jié)晶程度、化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)、微觀形貌、晶粒大小進(jìn)行分析。結(jié)果表明:復(fù)合材料由低結(jié)晶度的納米羥基磷灰石(5nm×60nm～20nm×100nm)和膠原蛋白纖維組成,二者之間形成了緊密鍵合。

以蠶絲絲素蛋白(sf)作為羥基磷灰石(ha)沉積的模板,制備ha/sf復(fù)合粉末,用掃描電鏡(sem)、熱重分析(tga)、x射線(xiàn)衍射(xrd)和傅立葉變換紅外光譜(ft-ir)對(duì)復(fù)合粉末進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果表明,合成產(chǎn)物是ha/sf復(fù)合物,其平均粒徑約為275.7nm,其中絲素蛋白含量為17.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。復(fù)合粉末經(jīng)等靜壓成型后能夠制得彎曲和壓縮強(qiáng)度分別為19.87mpa和28.65mpa的ha/sf復(fù)合材料,以nacl為致孔劑能夠制得平均孔徑約為61μm、孔隙率為40%的多孔ha/sf復(fù)合材料。

再生絲素蛋白具有良好的生物相容性,羥基磷灰石同時(shí)還具有成骨誘導(dǎo)性。通過(guò)將再生絲素蛋白制備形成絲素蛋白多孔材料,并在37℃下將其浸漬于模擬體液中可以制備再生絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料。掃描電鏡研究發(fā)現(xiàn)在再生絲素蛋白多孔材料的孔隙中羥基磷灰石由針狀晶體聚集而成,紅外光譜和xrd等表征表明復(fù)合材料中羥基磷灰石以羰基取代的羥基磷灰石存在。制備的再生絲素蛋白/羥基磷灰石多孔材料有望作為骨組織修復(fù)材料使用。

以含ca2+和po34-的溶液為無(wú)機(jī)相,殼聚糖(chitosan,cs)溶液為高分子相,采用原位水化法制備羥基磷灰石(hydroxyapatite,hap)/cs復(fù)合多孔支架材料。xrd和ir的表征和分析表明水化24h后,復(fù)合支架中的鈣磷鹽從磷酸氫鈣(dicalciumphosphatedehydrate,dcpd)轉(zhuǎn)化為hap。sem和eds顯示15μm左右的棒狀hap顆粒均勻地分散在多孔支架的孔壁上,壓縮強(qiáng)度的測(cè)試結(jié)果表明這種結(jié)構(gòu)顯著提高復(fù)合支架的力學(xué)性能。

采用硝酸鈣-絲素蛋白溶液與磷酸鈉反應(yīng)仿生合成納米羥基磷灰石/絲素蛋白(n-ha/sf)復(fù)合材料,并以nahco3和nacl為致孔劑制備了多孔復(fù)合支架材料,采用tem、ir、sem和edx對(duì)其進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,復(fù)合材料中ha的粒徑在20~50nm之間,是一種co32-部分替代型弱結(jié)晶類(lèi)骨針晶,在形貌和尺寸等方面類(lèi)似于人體骨磷灰石晶體;ha和sf兩相間存在強(qiáng)烈的鍵合作用,復(fù)合支架材料呈高度多孔結(jié)構(gòu),孔壁上富含微孔,孔隙間貫通性高。edx分析結(jié)果表明,ha在有機(jī)基體中分布均勻,鈣磷元素比為1.66,當(dāng)復(fù)合材料和致孔劑的比例為1∶0.5時(shí),其抗壓強(qiáng)度可達(dá)20.23mpa。

近年來(lái),隨著組織工程的深入研究,骨組織工程受到學(xué)者越來(lái)越多的重視。目前,骨組織工程的研究重點(diǎn)集中在支架材料、種子細(xì)胞、骨構(gòu)建的相關(guān)生長(zhǎng)因子等三個(gè)方面。納米羥基磷灰石(nanohydroxyaptite,nhap)屬于陶瓷類(lèi)材料,有利于人體骨組織的修復(fù)、整合及改善植入組織的力學(xué)性能,因其優(yōu)良的生物性能而備受關(guān)注,nhap已作為骨

本文以氫氧化鈣懸浮液和磷酸為主要實(shí)驗(yàn)原料,在室溫25℃,ph值為11的條件下,用共滴定的方法合成羥基磷灰石。把羥基磷灰石粉與一定量的膠原蛋白溶液混合,經(jīng)過(guò)物理發(fā)泡、冷凍、微波干燥的過(guò)程,得到羥基磷灰石/膠原蛋白多孔支架材料。運(yùn)用xrd、sem分析儀器和阿基米德原理及杠桿原理,對(duì)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明用物理發(fā)泡法制得的多孔支架材料的總氣孔率為79%～89%,抗壓強(qiáng)度為0.3～1.1mpa。

用氫氧化鈣與磷酸濕法合成羥基磷灰石,加入絲素蛋白以誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體的定向生長(zhǎng),以仿生的方法得到復(fù)合顆粒。通過(guò)掃描電子顯微鏡(sem)、電子探針?lè)治?eds)、x-射線(xiàn)衍射(xrd)、紅外吸收光譜(ft-ir)、粒徑分析儀等檢測(cè)手段,探討了制備工藝條件對(duì)羥基磷灰石絲素復(fù)合粉體制備的影響及其合成機(jī)理。結(jié)果表明,制備的復(fù)合顆粒為納米級(jí)粉體,長(zhǎng)度在100～400nm,寬度在30～80nm之間。絲素蛋白可以誘導(dǎo)羥基磷灰石形成針狀晶體,晶體的長(zhǎng)軸方向沿著c軸方向,這是因?yàn)榻z素蛋白與羥基磷灰石之間的相互作用造成的。并且隨著絲素蛋白加入量的增加,長(zhǎng)徑比增加,隨著溫度的增加,結(jié)晶度增加,其組成和結(jié)構(gòu)與人骨組織中納米微晶非常相似。由于羥基磷灰石絲素蛋白復(fù)合納米粒子與人骨中磷灰石微晶的相似性以及基體材料的可降解性,這些材料被賦予優(yōu)異的骨誘導(dǎo)性能和可降解性能,在骨修復(fù)或骨固定材料方面有著潛在的用途,可以為適合于臨床應(yīng)用的ha產(chǎn)品提供優(yōu)質(zhì)的粉體原料。

研究利用造孔劑法制備高度貫通的多孔羥基磷灰石(ha)支架,孔隙率約為78%,并利用聚己內(nèi)酯(pcl)分別復(fù)合納米ha(nha)或微納米生物玻璃(nbg)粉末對(duì)其進(jìn)行涂覆改性,粉末的添加量均為10%~40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。4種類(lèi)型支架分別記為ha、pcl/ha、nha-pcl/ha和nbg-pcl/ha。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),nha-pcl/ha和nbg-pcl/ha復(fù)合支架最大抗壓強(qiáng)度分別為1.41~1.98mpa和1.35~1.78mpa。4類(lèi)支架礦化實(shí)驗(yàn)顯示,浸泡21d后nbg-pcl/ha表面促進(jìn)生成較多的磷灰石礦化物;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞在4類(lèi)支架上均生長(zhǎng)良好,說(shuō)明支架具有良好的生物相容性。支架在實(shí)驗(yàn)犬背部肌肉組織內(nèi)植入2個(gè)月的組織學(xué)檢測(cè)顯示,4種支架內(nèi)均有新骨形成,尤其是nha-pcl/ha和nbg-pcl/ha孔內(nèi)有更多的新生骨組織,說(shuō)明這兩種支架表面復(fù)合涂層中的生物活性納米顆粒對(duì)誘導(dǎo)新骨生成具有積極的促進(jìn)作用。

了解絲素蛋白(silkfibroin,sf)表面修飾的羥基磷灰石(hydroxyapatite,ha)修復(fù)骨缺損過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液流變學(xué)和骨缺損修復(fù)區(qū)血流量的變化。選擇20只新西蘭白兔,制作15mm長(zhǎng)的橈骨節(jié)段性骨缺損模型,根據(jù)植入不同移植材料分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組于動(dòng)物左側(cè)橈骨缺損區(qū)植入mscs復(fù)合sf表面修飾的ha培養(yǎng)制備的組織工程骨,對(duì)照組植入mscs復(fù)合ha培養(yǎng)制備的組織工程骨,觀察各組動(dòng)物術(shù)后7、14d血液流變學(xué)和術(shù)后14d骨缺損修復(fù)區(qū)血流量的變化。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,血液流變學(xué)指標(biāo)和骨缺損修復(fù)區(qū)血流量差異顯著,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身血液粘度降低,骨缺損修復(fù)區(qū)的局部血流量增加。sf表面修飾對(duì)以ha為支架材料組織工程骨的修復(fù)作用有明顯優(yōu)化作用。

為了探討絲素蛋白/羥基磷灰石(sf/ha)復(fù)合多孔支架材料的制備及其用于骨缺損的修復(fù),采用超聲波凝膠干燥法制備了sf/ha復(fù)合材料;以脫膠繭絲為增強(qiáng)材料,水溶性淀粉為制孔劑,通過(guò)去離子水萃取法除去淀粉,制備了sf/ha多孔復(fù)合材料。對(duì)其孔隙率及抗壓強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試,并將其植入兔股骨缺損處觀察修復(fù)的情況。sf/ha多孔復(fù)合材料的孔隙率接近75%,孔徑尺寸分布約從幾微米到400μm,并且孔隙之間相互貫通,其抗壓強(qiáng)度可達(dá)10mpa以上,植入兔股骨缺損處未見(jiàn)引起骨組織明顯的炎癥反應(yīng)及骨壞死,術(shù)后12周發(fā)現(xiàn)基本修復(fù)骨缺損部位,而空白對(duì)照組沒(méi)有骨生成。sf/ha多孔復(fù)合材料可以滿(mǎn)足骨組織工程支架的基本要求,用于骨缺損的修復(fù)。

應(yīng)用共混法制備了納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合支架材料,通過(guò)體外降解和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究了復(fù)合支架材料的降解特性和生物相容性.體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)合支架材料具有穩(wěn)定的降解能力;在降解過(guò)程中,羥基磷灰石由于與降解液發(fā)生鈣、磷等離子的交換,使其結(jié)晶得到了進(jìn)一步生長(zhǎng)和完善.利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽(mtt)比色法和堿性磷酸酶(alp)活性測(cè)定等分析了復(fù)合支架材料的生物相容性,結(jié)果表明,mg63細(xì)胞在復(fù)合支架材料上具有良好的粘附、增殖能力,并可引起早期的骨分化.因此,納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合支架作為骨組織工程的支架材料具有良好的應(yīng)用前景。

由納米羥基磷灰石(ha)與絲素蛋白(sf)復(fù)合而成的新型生物復(fù)合材料,具有優(yōu)良的生物相容性,已被研究用作骨移植及填充材料,但其由絲素蛋白分子內(nèi)交聯(lián)導(dǎo)致的較差的力學(xué)性能,限制了該復(fù)合材料的應(yīng)用。本研究中,采用一種名為聚乙二醇二縮水甘油醚(pgde)的交聯(lián)劑對(duì)復(fù)合材料中的絲素蛋白進(jìn)行改性。該改性的復(fù)合材料經(jīng)過(guò)一系列的檢測(cè),結(jié)果顯示交聯(lián)劑pgde可以提高絲素蛋白的結(jié)晶性,復(fù)合材料ha/sf的抗壓強(qiáng)度提高了100%,且該交聯(lián)劑并沒(méi)有影響復(fù)合材料的生物相容性。

以共沉淀法制備了羥基磷灰石/絲蛋白(ha/sf)復(fù)合骨修復(fù)材料,并對(duì)材料進(jìn)行了xrd、tem、sem、孔徑分布和孔隙率等相關(guān)的測(cè)試和表征。結(jié)果表明:該復(fù)合材料的無(wú)機(jī)組分為20~30nm長(zhǎng)、5nm寬的棒狀羥基磷灰石(ha)結(jié)晶,這些晶粒沿c軸自組裝團(tuán)聚成簇分散在絲蛋白基質(zhì)中形成三維多孔結(jié)構(gòu),其孔徑分布在0.3~115μm之間,開(kāi)口孔隙率達(dá)66%。該材料植入動(dòng)物體內(nèi),未出現(xiàn)明顯的排異反應(yīng),在植入部位有連續(xù)的骨性連接和新生骨形成,說(shuō)明ha/sf復(fù)合材料具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)活性。

納米羥基磷灰石復(fù)合材料是一種新型骨組織替代或修復(fù)材料。介紹了羥基磷灰石的特性、合成方法，總結(jié)了改性研究及應(yīng)用，闡述了納米羥基磷灰石復(fù)合材料生物相容性。

納米羥基磷灰石（nhap）是一種性能優(yōu)良的骨修復(fù)材料,但由于其脆性大、強(qiáng)度低而限制了它在承力部位的應(yīng)用。nhap與其他材料復(fù)合可以提高材料生物相容性和力學(xué)性能,具有更大的臨床應(yīng)用前景?，F(xiàn)就各種nhap復(fù)合支架的種類(lèi),以及nhap復(fù)合材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合來(lái)構(gòu)建組織工程化骨的研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

通過(guò)體外模擬天然骨生物礦化和材料自組裝的形成機(jī)制,研究制備了類(lèi)骨羥基磷灰石/膠原仿生復(fù)合材料并對(duì)材料進(jìn)行了表征。結(jié)果表明:納米羥基磷灰石均勻分布在膠原基質(zhì)上并擇優(yōu)取向排列,該復(fù)合材料的成分和微觀結(jié)構(gòu)與天然骨類(lèi)似。

通過(guò)優(yōu)化的加工條件制備了羥基磷灰石/熱致液晶高分子(ha/vectraa950)復(fù)合材料仿生人工骨,研究了ha含量對(duì)復(fù)合材料顯微結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的影響,分析了ha與vectraa950共混后的力學(xué)性能以及界面結(jié)合問(wèn)題。研究結(jié)果表明:當(dāng)ha與vectraa950的質(zhì)量比小于10∶100時(shí),復(fù)合材料呈現(xiàn)明顯的皮芯結(jié)構(gòu),皮層液晶微纖高度取向,ha主要分散在芯部,其模量和強(qiáng)度達(dá)到或超過(guò)天然骨的力學(xué)性能;隨著ha含量的增加,皮芯結(jié)構(gòu)逐步減弱并消失,而缺陷顯著增加。當(dāng)ha與vectraa950的質(zhì)量比增加到20∶100,復(fù)合材料的力學(xué)性能、尤其是韌性顯著降低,這可能是由于ha顆粒與液晶基體之間的結(jié)合較差導(dǎo)致的。為保證復(fù)合材料仿生人工骨的生物活性,ha的含量應(yīng)與天然骨接近。因此,需對(duì)ha和vectraa950的界面進(jìn)行改性以提高其結(jié)合性能。

目的比較復(fù)合不同劑量血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)的納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨(nhac)修復(fù)骨缺損的效果。方法將納米羥基磷灰石粉末和膠原蛋白粉末按8∶2的比例混合制備nhac人工骨,再將混合粉末與含10ng、100ng、300ngvegf的蒸餾水按1∶1.8的質(zhì)量比調(diào)和制備nhac/vegf人工骨。建立大鼠雙側(cè)橈骨0.5cm缺損動(dòng)物模型30只,按隨機(jī)原則分為5組。以nhac/10ngvegf、nhac/100ngvegf、nhac/300ngvegf人工骨植入骨缺損處進(jìn)行修復(fù)作為實(shí)驗(yàn)組,以nhac人工骨植入組及空白組作為對(duì)照組。術(shù)后2、4、8周各組行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查,觀察材料早期血管化及成骨情況。結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)評(píng)分以及血管計(jì)數(shù)均為nhac/300ngvegf人工骨組最高,于其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組血管數(shù)量在4周時(shí)達(dá)到高峰,而nhac組血管數(shù)量在8周時(shí)最多。結(jié)論血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能明顯促進(jìn)nhac早期血管化及新骨形成,比單純應(yīng)用nhac能更好的修復(fù)骨缺損,并且隨著vegf劑量的增加,新生血管數(shù)量和新骨形成量均相應(yīng)增加。

以ca(oh)2和h3po4為反應(yīng)物,通過(guò)溶膠-凝膠法制備了羥基磷灰石(ha)粉體;用機(jī)械混合法制備了tih2包覆ha的粉體;用熱壓法制備了純ha陶瓷材料及ha/ti復(fù)合材料.xrd相分析結(jié)果表明:通過(guò)溶膠-凝膠法制備的ha粉體,經(jīng)過(guò)900℃煅燒2h后,粉體的主晶相為ha,有少量的cao;ha/tih2包覆粉末經(jīng)1050℃熱壓后,復(fù)合材料中的主要相是ha和ti,同時(shí)出現(xiàn)了ca2p2o7和ca3(po4)2相.1050℃熱壓的ha/25%ti(體積分?jǐn)?shù))復(fù)合材料的斷裂韌性為2.4mpa.m-1/2,抗彎強(qiáng)度為54mpa,均高于純ha材料.顯微組織的觀察表明金屬鈦在材料中呈網(wǎng)狀分布,網(wǎng)狀分布的金屬相能夠通過(guò)裂紋橋接機(jī)制阻止ha基體中的裂紋的擴(kuò)展.

低溫下,通過(guò)將水熱合成的納米羥基磷灰石漿料與中性膠原溶膠共混和在中性膠原中原位形成羥基磷灰石兩種方法制備羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料,采用xrd、ftir、掃描電鏡、透射電鏡和力學(xué)性能測(cè)試等方法對(duì)兩種復(fù)合材料的特性進(jìn)行了表征。通過(guò)對(duì)兩種方法制備的復(fù)合材料的特性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩種方法均制備得到了納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料,復(fù)合材料在晶相組成、化學(xué)組成、納米羥基磷灰石晶體尺寸、膠原纖維的結(jié)構(gòu)等方面都與天然骨相似。但原位合成納米羥基磷灰石晶體的結(jié)晶度比水熱合成的納米羥基磷灰石更接近于自然骨,原位合成的羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料的均勻性、界面結(jié)合緊密度、力學(xué)性能等方面均優(yōu)于共混法。原位合成法是改善納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料均勻性和力學(xué)性能的有效方法。