正交設(shè)計(jì)優(yōu)化假儉草SRAP-PCR反應(yīng)體系及引物篩選

以sds法提取的結(jié)縷草屬植物葉片dna為模板,分別采用單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)2種方法,對影響結(jié)縷草屬植物srap-pcr的mg2+、dntp、引物、taqdna聚合酶和模板dna五個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。單因子試驗(yàn)分別研究各因素在多水平條件下對srap-pcr反應(yīng)體系的影響,得到最佳反應(yīng)條件。正交設(shè)計(jì)采用l16(45)方案,綜合考慮各因素間的相互作用,通過直觀分析法獲得各影響因素的最佳反應(yīng)水平。根據(jù)4對引物對6份結(jié)縷草屬植物材料擴(kuò)增結(jié)果的驗(yàn)證比較,2種方法所獲得的最佳反應(yīng)體系存在一定的差異。通過綜合比較和分析2種方法的優(yōu)化體系擴(kuò)增出的條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性比率,最終建立了結(jié)縷草屬植物srap-pcr的最佳反應(yīng)體系:mg2+2.00mmol/l、dntp220μmol/l、引物0.20μmol/l、taqdna聚合酶0.50u、模板dna60ng、2μl10×buffer,總體積為20μl。這一優(yōu)化體系的建立為今后利用srap標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行結(jié)縷草屬植物遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜及親緣關(guān)系分析等方面的研究提供了科學(xué)的依據(jù)。

【目的】優(yōu)化大旗瓣鳳仙issr-pcr反應(yīng)體系,為大旗瓣鳳仙遺傳多樣性分析提供技術(shù)參考?！痉椒ā坷谜辉囼?yàn)設(shè)計(jì)對大旗瓣鳳仙issr-pcr反應(yīng)體系的5個(gè)因素(mg2+、dntp、引物、taqdna聚合酶、模板dna)4水平進(jìn)行優(yōu)化分析,并在此基礎(chǔ)上對pcr反應(yīng)過程中的退火溫度進(jìn)行篩選?！窘Y(jié)果】建立了大旗瓣鳳仙issr-pcr的優(yōu)化反應(yīng)體系,即在25.0μl反應(yīng)體系中含1×pcrbuffer、mg2+1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.8μmol/l、taqdna聚合酶0.75~1.00u、模板dna100ng。通過該體系可以篩選出6條對大旗瓣鳳仙種群擴(kuò)增效果較好的引物?！窘Y(jié)論】優(yōu)化的issr-pcr反應(yīng)體系具有較高的穩(wěn)定性,可用于大旗瓣鳳仙及鳳仙屬植物種群的issr遺傳多樣性分析。

以假儉草為材料,對影響issr-pcr擴(kuò)增結(jié)果的因素進(jìn)行了探討,建立了適合假儉草issr-pcr分析的最佳反應(yīng)體系。表明在20μl總體積中,包含40ng模板dna、issr引物0.4μmol/l、dntps0.1mmol/l、mg2+1.0mmol/l0、.1utaqdna聚合酶和10×buffer2.0μl。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸1.5min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。

為了豐富柳樹分子標(biāo)記的手段,以旱柳salixmatsudana為材料,通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,獲得適于旱柳的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,srap)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)體系;對srap-pcr擴(kuò)增過程中的2次退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如下:優(yōu)化反應(yīng)體系,25.00μl反應(yīng)液中,含20.84nkat的taq酶,2.00μlmg2+(25.00mmol·l-1),2.50μl堿基混合物(脫氧核糖核苷酸dntps,各2.50mmol·l-1),1.50μl引物(20.00μmol·l-1),100.00ngdna模板,2.50μl10×taq酶緩沖液。擴(kuò)增程序,94℃2.0min;94℃1.0min,38℃1.0min,72℃1.5min,5個(gè)循環(huán);94℃1.0min,54℃1.0min,72℃1.5min,30個(gè)循環(huán);72℃10.0min。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)檢測,特征性條帶清晰,信息量大,完全可以用于旱柳基因組的研究分析。

采用單因子試驗(yàn)與正交試驗(yàn)的方法,研究了海南龍血樹(dracaenacambodianapierreexgagnep)issr-pcr反應(yīng)體系中的主要影響因子,篩選出16條有效引物并優(yōu)化了它們的退火溫度,此外還檢測了體系的重復(fù)性。優(yōu)化后的25μl反應(yīng)體系包含:10×pcrbuffer2.5μl,3.0mmol/lmgcl2,300μmol/ldntps,taq聚合酶3.0u,引物0.2μmol/l,dna模板20ng。該反應(yīng)體系可用于海南龍血樹的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

比較ctab法和sds法提取叉葉蘇鐵(cycasmicholitzii)的總dna,發(fā)現(xiàn)ctab法是提取叉葉蘇鐵總dna的較好方法;對叉葉蘇鐵issr-pcr反應(yīng)體系中的4個(gè)主要因素dntps,taqdna聚合酶,引物及mg2+進(jìn)行最優(yōu)條件篩選;采用單因素法探討dna模板量、退火溫度和循環(huán)次數(shù)的最佳反應(yīng)條件,建立了適合于叉葉蘇鐵的最佳issr-pcr反應(yīng)體系(20μl體系):1×buffer,75ngdna模板,dntps250μmol·l-1,taq酶1.0u,引物0.2μmol·l-1,mg2+2.5mmo·ll-1,反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,52℃退火1min,72℃延伸2min,循環(huán)40次,72℃延伸10min,4℃保存。本研究結(jié)果為蘇鐵綱植物的分子生物學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究提供理論參考。

以文心蘭‘小櫻桃’花梗腋芽誘導(dǎo)出的叢生芽為增殖培養(yǎng)材料,采用正交設(shè)計(jì)法,研究基本培養(yǎng)基、6-ba、naa和水解乳蛋白(lh)4種因素對文心蘭叢生芽增殖的影響,以期篩選出各因子的最佳水平,建立文心蘭‘小櫻桃’叢生芽增殖培養(yǎng)體系。結(jié)果表明:各試驗(yàn)因素對文心蘭叢生芽增殖影響的主次關(guān)系為6-ba>基本培養(yǎng)基>naa>lh;篩選出文心蘭叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基配方為改良1號+6-ba3.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1+lh0.5g·l-1,45d平均增殖系數(shù)達(dá)6.53,有效提高了繁殖效率,為其種苗工程化育苗提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

斑潛蠅隸屬雙翅目(diptera)潛蠅科(agromyzidae)斑潛蠅屬(liriomyza),是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲。近年來,隨著海峽兩岸果蔬貿(mào)易的快速發(fā)展,斑潛蠅類害蟲傳入大陸地區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,植物檢疫部門急需該類害蟲的快速鑒定技術(shù)和方法。本研究針對我國進(jìn)境檢疫性害蟲三葉草斑潛蠅(l.trifolii),在檢測和檢索其線粒體dna細(xì)胞色素氧化酶i(mtdnacoi)基因序列并與其近緣種美洲斑潛蠅(l.sati-vae)和南美斑潛蠅(l.huidobrensis)相同基因序列比對的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)并篩選了其種類識別特異引物,初步實(shí)現(xiàn)了三葉草斑潛蠅的快速鑒定。

運(yùn)用單因素試驗(yàn)法對影響也門鐵issr-pcr擴(kuò)增的各個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化體系為:25μl反應(yīng)體系中,taq酶濃度0.04u.μl-1、dntps濃度0.18mmol.l-1、引物濃度0.4μmol.l-1、mg2+濃度2.0mmol.l-1、模板濃度0.8ng.μl-1、甲酰胺濃度1.6%、1×buffer,最后用ddh2o補(bǔ)足到25μl。利用優(yōu)化體系和篩選的引物對也門鐵及其嵌合體品種進(jìn)行了issr擴(kuò)增分析。

以sds法提取的結(jié)縷草(zoysiaspp.)葉片dna為模板,應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),從mg2+、dntp、引物和dna聚合酶并通過比較不同濃度的模板dna對pcr擴(kuò)增的影響,確立結(jié)縷草屬植物issr-pcr反應(yīng)的最佳體系。結(jié)果表明:各因素不同濃度對pcr反應(yīng)結(jié)果有顯著影響,正交設(shè)計(jì)可以用于issr反應(yīng)體系建立,該方法建立的結(jié)縷草屬植物issr-pcr優(yōu)化反應(yīng)體系為10xbuffer7、0ng模板dna、mg2+2.0mmol.l-1、dntp150μmol.l-1、primer0.3μmol.l-1、taqdna聚合酶1.0u,總體積20μl;經(jīng)對11份結(jié)縷草屬植物進(jìn)行檢驗(yàn),證明該體系穩(wěn)定可靠。該體系的建立可為今后利用issr標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行結(jié)縷草屬遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析等提供依據(jù)。

采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對影響海南龍血樹rapd-pcr反應(yīng)的模板dna量、mg2+、dntp和引物濃度,taq聚合酶用量等因子進(jìn)行研究,分析各因子對rapd-pcr擴(kuò)增結(jié)果的影響,確立了海南龍血樹rapd-pcr反應(yīng)的最佳條件,即在25μl反應(yīng)體系中,包含10×buffer2.5μl,2.0mmol/lmgcl2,300μmol/ldntps,taq酶1.5u,引物0.8μmol/l和dna模板20ng。以此條件為基礎(chǔ),篩選出適用于海南龍血樹rapd-pcr分析的18條有效引物,為采用rapd技術(shù)分析海南龍血樹種群遺傳變異水平和遺傳結(jié)構(gòu)打下了基礎(chǔ)。

分別采用單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對影響紅花檵木rsap-pcr反應(yīng)體系的5個(gè)因素(dna模板量、mg2+濃度、dntps濃度、引物濃度、taq酶量)在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明,2種方法得到的影響因素的最優(yōu)水平存在差異,通過綜合比較與分析,選取紅花檵木rsap-pcr最優(yōu)反應(yīng)體系為:在25μl的反應(yīng)體系中,模板量70ng,mg2+濃度1.50mmol/l,dntps濃度0.25mmol/l,引物濃度0.20mmol/l,taq酶量2.50u.

利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),對影響issr-pcr的mg2+、dntps、引物、taqdna聚合酶和模板dna5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明:25μlissr-pcr反應(yīng)體系中各因素的最佳條件為mg2+2.5mmol/l、dntps0.25mmol/l、引物0.2μmol/l、taqdna聚合酶1.0u,模板dna40ng。通過對狗牙根issr-pcr最佳反應(yīng)體系進(jìn)行梯度退火試驗(yàn),得到引物ubc881的最佳退火溫度為50.5℃。該體系在24個(gè)狗牙根種質(zhì)中獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果,該優(yōu)化體系為今后利用issr技術(shù)進(jìn)行狗牙根屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

本文采用可見分光光度法,測定新疆農(nóng)六師103團(tuán)產(chǎn)網(wǎng)紋甜瓜子中總黃酮的含量。通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝,結(jié)果可知,料液比5:1,溫度為80℃,提取3次,每次3h時(shí)提取效果最好,總黃酮含量為8.52%,該方法簡便,快速,可為后續(xù)開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

以西洋杜鵑(rhododendronhybridum)葉片提取的基因組dna為材料,用引物ubc880(序列為ggagaggagaggaga)研究了pcr反應(yīng)體系的主要成分及退火溫度對該種植物issr擴(kuò)增結(jié)果的影響。確立了可用于西洋杜鵑issr-pcr分析的最適宜的pcr反應(yīng)體系:20μlpcr反應(yīng)體積中,含10ng模板dna,0.25mmol.l-1dntps,2.0mmol.l-1mg2+,1.0utaqdna聚合酶,0.4μmol.l-1引物,并確定引物ubc880的最適退火溫度為54.4℃。pcr擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,54.4℃退火45s,72℃延伸1.5min,共40個(gè)循環(huán)后,72℃延伸7min,4℃保存。應(yīng)用該issr體系對11份西洋杜鵑種質(zhì)進(jìn)行了擴(kuò)增,證實(shí)了該體系的適用性和穩(wěn)定性。

為建立鵝掌楸簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增issr的pcr優(yōu)化反應(yīng)體系,以鵝掌楸葉片基因組dna為材料,系統(tǒng)地測試了模板dna、引物、dntps、mg2+濃度、taqdna聚合酶用量及退火溫度對issr-pcr反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明:優(yōu)化的pcr反應(yīng)體系為:20μl總體系中,含30ng模板dna,0.3μmol.l-1隨機(jī)引物,0.2mmol.l-1dntps,1.4mmol.l-1mg2+,0.8utaqdna聚合酶;最佳退火溫度為60℃;pcr反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,60℃退火45s,72℃延伸2min;45個(gè)循環(huán);72℃再延伸7min。

issr標(biāo)記能揭示出種間、種內(nèi)遺傳變異情況,更好地揭示親緣關(guān)系和遺傳多樣性。以大花萱草的5個(gè)品種為試材,研究了影響大花萱草issr-pcr擴(kuò)增效果的各項(xiàng)因素,建立了適合大花萱草issr-pcr的最佳反應(yīng)體系:20μl反應(yīng)體系中,10×buffer2μl,dntp0.2mmol/l,mg2+濃度1.5mmol/l,引物濃度0.5mmol/l,taq酶10.002nkat,dna模板20ng。大花萱草的最佳issr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性40s,50℃退火45s,72℃延伸1.5min,共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。通過該反應(yīng)程序進(jìn)行的大花萱草issr擴(kuò)增可獲得清晰、穩(wěn)定的條帶。

[目的]建立貫葉連翹的issr-pcr反應(yīng)體系,并對其條件進(jìn)行優(yōu)化。[方法]以貫葉連翹基因組dna為模板,用l16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)分析引物濃度、taqdna聚合酶濃度、mg2+濃度、dntp濃度和模板dna濃度5種因素對貫葉連翹issr-pcr反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果的影響。[結(jié)果]正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法可以用于貫葉連翹issr-pcr反應(yīng)體系的建立,經(jīng)過優(yōu)化得到貫葉連翹issr-pcr反應(yīng)體系的最佳條件為:20μlissr-pcr反應(yīng)體系中含10×pcrbuffer,mg2+濃度1.2mmol/l,taqdna聚合酶濃度50u/ml,dna濃度20ng/μl,dntp濃度250μmol/l,引物濃度0.75μmol/l。[結(jié)論]試驗(yàn)建立的貫葉連翹的issr-pcr反應(yīng)體系重復(fù)性好、分辨率高,結(jié)果穩(wěn)定可靠。

目的優(yōu)選野葛藤中異黃酮的提取工藝。方法以葛藤異黃酮得率為評價(jià)指標(biāo),通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化葛藤異黃酮的提取工藝,并對最佳提取工藝進(jìn)行工藝驗(yàn)證。結(jié)果葛藤異黃酮的最佳提取工藝為:乙醇濃度為50%,料液比1:20,超聲提取時(shí)間30min,超聲溫度為20℃,異黃酮的提取率可達(dá)3.86%。結(jié)論采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化對葛藤異黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化合理可行。

采用單因子和正交設(shè)計(jì)2種方法,對影響廣玉蘭issr-pcr反應(yīng)體系的5個(gè)因素(taq酶、mg2+、dntp、引模板dna)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:正交設(shè)計(jì)采用直觀分析法獲得影響因素最佳反應(yīng)水平與單因子試驗(yàn)找出影響因素最佳反應(yīng)水平有一定差異,通過綜合比較分析,最終建立了廣玉蘭issr-pcr的最佳反應(yīng)體系:在20μl的反應(yīng)體系中,taqdna聚合酶1.0u、mg2+1.2～1.5mmol/l、dntp1.80mmol/l、引物0.5～0.6μmol/l、30ng模板dna、10×pcrbuffer。同時(shí),通過pcr比較,確定延伸時(shí)間為2min,循環(huán)次數(shù)為35個(gè)較為合適,確定了引物最佳退火溫度,得到了廣玉蘭issr-pcr反應(yīng)的最佳擴(kuò)增程序。

采用單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法,對影響闊葉十大功勞issr-pcr反應(yīng)體系的引物、taqdna聚合酶、dntps、模板dna及退火溫度5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,為探討闊葉十大功勞種質(zhì)遺傳多樣性奠定基礎(chǔ).結(jié)果表明:闊葉十大功勞issr-pcr的最佳反應(yīng)體系為:在20μl反應(yīng)體系中,0.5μmol/l引物、0.5utaq酶、150μmol/ldntps和20ng模板dna.在最佳反應(yīng)條件下,從80條引物中篩選出15條擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的issr引物,并經(jīng)過9份闊葉十大功勞種質(zhì)檢驗(yàn),證明該體系具有擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn).綜上所述,本文所建立的issr-pcr反應(yīng)體系可用于闊葉十大功勞的種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析.

以香石竹葉片為外植體,利用二次回歸正交設(shè)計(jì)對其再生體系建立中的關(guān)鍵因素6-ba和naa的濃度及其組合進(jìn)行定量優(yōu)化。結(jié)果表明,增殖培養(yǎng)基中6-ba濃度為1.21mg/l、naa濃度為0.35mg/l時(shí),不定芽增殖數(shù)量可達(dá)3.65;6-ba濃度為1.20~1.79mg/l,naa濃度為0.15~0.63mg/l時(shí),不定芽增殖系數(shù)大于2,可靠性為95%。