冰凍切片應用

（1）在手術進行中，突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷，原定手術方案不相符合，或者懷疑時，需要病理確定。

（2）了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定是否需要徹底掃除淋巴結(jié)或者其它的治療措施。

（3）對于已確定為惡性腫瘤的患者，則需要了解其手術范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。

（4）在做剖腹探查時所發(fā)現(xiàn)的腫塊或者異樣的組織。

（5）顯示組織中的脂肪和脂類物質(zhì)，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。

（6）某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等。

（7）神經(jīng)病理學技術中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。

（8）對某些物質(zhì)所進行的免疫熒光的研究。

冰凍切片（frozen section）是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用于手術中的快速病理診斷。冰凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。這些方法，隨著時代的變遷，科技的發(fā)展，許多年前被認為是非常重要的技術，也逐步被淘汰了。當然有些技術，如低溫恒冷箱冰凍切片法，正在受到重視。

術中為何做冰凍切片？

病理檢查首先需要將切下的病變組織器官作一系列技術處理，包括固定、取材、脫水、浸蠟、包埋、切片和染色等，一般需花費24小時方可完成全部制片過程，然后由病理醫(yī)生用顯微鏡觀察，并做出診斷。這種檢查方法稱為常規(guī)石蠟切片，是病理檢查中最常用的方法。但是，這種方法從外科醫(yī)生將病變組織切下，到做出病理診斷，前后通常需要3天的時間。有時外科醫(yī)生希望在手術過程中馬上了解病變的性質(zhì)，以便及時確定手術范圍，并做出相應的處理，就要求病理醫(yī)生在手術過程中做出病理診斷，此時就必須快速切片診斷，快速冰凍切片是應用的最廣泛的方法。

快速冰凍切片是用于手術中病理診斷的一種方法，病理醫(yī)生在收到手術標本后約15分鐘之內(nèi)做出診斷，馬上電話告訴手術醫(yī)生，以便迅速作出下一步治療決策。病理診斷的正確與否直接關系到手術臺上處理患者的下一個步驟，如乳腺腫塊切除后的冰凍報告是良性的纖維腺瘤，則可宣告手術結(jié)束；如冰凍報告是乳腺癌，就需要進一步擴大手術范圍，切除整個乳房及腋窩淋巴結(jié)；肢體的惡性腫瘤如骨肉瘤，通常需截肢。冰凍切片病理診斷對手術治療有重大幫助和指導意義，診斷要力求正確、迅速和可靠。

然而，快速冰凍切片要在如此之短的時間內(nèi)做出診斷，難度相當高，取材有局限性，制作切片的質(zhì)量也不如常規(guī)石蠟切片高。因此，冰凍切片的確診率比常規(guī)切片低，有一定的延遲診斷率和誤診率，所以冰凍切片診斷尚不能廣泛應用，即使選擇性應用，事后仍需用常規(guī)石蠟切片對照和存檔。

快速冰凍切片主要用于下列幾種情況：

①確定病變是否為腫瘤；

②判斷腫瘤的良惡性；

③了解腫瘤有無播散到鄰近淋巴結(jié)或臟器；

④確定手術切緣有無腫瘤浸潤，以了解手術范圍是否足夠大；

⑤幫助識別手術中某些意外和確定可疑微小組織（如甲狀旁腺、輸卵管或輸精管等）；

⑥取新鮮組織供激素受體測定、腫瘤藥敏試驗、電鏡檢查和分子生物學檢查等特殊需要。

低溫恒冷箱冷凍切片制作法

以Shandon As 620 E型恒溫箱冷凍切片機為例，該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10分鐘。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15分鐘。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一周的工作或者一天的工作后，啟動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時的進退。

冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來。

操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。

④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細心，準確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當?shù)奈恢?。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調(diào)至-30℃。

冰凍切片時的注意事項：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。

③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水分就存留于組織中，形成了冰晶。

⑤當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。

⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。

冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼于載玻片后，即用電吹風吹干后再固定。根據(jù)實驗對比認為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鐘。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鐘。

④ 分化。

⑤ 于堿水中返藍20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘。總共在10分鐘內(nèi)完成快速制片過程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這里不作闡述。

冰凍切片優(yōu)點

1．簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。

2．快速，用時短。

3．組織變化不大。

4．能很好保存脂肪，類脂等成分。

5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。

冰凍切片缺點

1．不容易做連續(xù)切片。

2．切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。

3．不容易制作較薄的切片。

4．組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。

新鮮組織的制備

組織盡可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：① CO2氣（－78℃） ② 丙酮干冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷卻的丙烷（－19℃）。液氮適用于組織化學，較安全。缺點：組織塊易發(fā)生龜裂。

固定組織的制備

為防止水解酶和其他物質(zhì)的移位、彌散，常用4℃、24小時的甲醛固定能很好地保存酶類。但對許多脫氫酶和轉(zhuǎn)移酶能滅活。故不宜使用，低溫，冷甲醛短時間固定（10分鐘左右）固定，可顯示琥珀酸脫氫酶。

電鏡出現(xiàn)后，需要保存細胞的超微結(jié)構(gòu)，以4%緩沖戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定較好。這些固定液主要用于水解酶，而不適于許多氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。

恒冷箱的溫度

一般在冷凍后10分鐘，到接近冷室溫度時再切，一般組織在－15～－20℃切片最易成功。每種組織有其合適的切片溫度、刀的溫度和冷室溫度，Pearse及Bancroft的經(jīng)驗如下：

組織 刀溫度 組織溫度 恒冷箱溫度

肝 -18 -10 -5

腎 -15 -8 -5

皮膚 -35 -10 -5

腦 -18 -5 -5

固定組織一般高3-5度

切片機的使用

抗卷板的前緣與刀面須有足夠的距離，使切片平滑通過。抗卷板略高于刀面的最高點?？蓱{經(jīng)驗調(diào)整刀對組織的角度，一般新刀為20゜。操作程序：先接通電源，調(diào)定恒冷箱溫度，調(diào)整切片刀的角度，調(diào)定切片厚度，標本置載臺致冷達所需溫度后，將其安放在切片機推進器上。即可切片。恒冷箱視使用情況每周或每月清潔一次冰霜。新刀切片滿意，舊刀用自動磨刀機磨刀較好。如果切片刀與抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把銳利的刀，就能獲得理想的切片。

冰凍干燥

原理

為冰凍組織保持高度真空，直到去除組織中的水分。

過程

小塊組織驟冷→立即在真空干燥脫水（－30～－40℃）冰升華，水氣去除，不會發(fā)生酶的彌散→材料干后，升到室溫浸于石蠟或碳蠟包埋。

特點

能出色地保存組織的酶活性，還有助于保持組織的結(jié)構(gòu)。但儀器貴，需時長。

冰凍替代法

原理

低溫下用液體脫水劑取代組織中的水分。

過程

組織塊驟冷→組織內(nèi)的水，在低溫（－40℃～－70℃）液體脫水劑中被替代（醇、丙酮），同時起到固定作用→脫水組織漸恢復到室溫，用石蠟包埋。

特點

① 新鮮組織在24小時內(nèi)制成切片。

② 可保存較多的酶活性。

③ 經(jīng)濟、簡單且有重復性，但對細胞器保存不佳，不能用于電鏡。

防止脫片的方法

冰凍切片是較難掌握的病理實驗技術之一，要做好一張冰凍切片絕不能只求速度，否則常適得其反[2，3]。為了不漏診、誤診，及時準確地作出診斷，確保結(jié)果科學性、正確性、真實性，這就需要醫(yī)護人員在進行冰凍切片時應有嚴格的責任心、嚴謹?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、密切聯(lián)系臨床、豐富的工作實踐經(jīng)驗，不斷提高切片質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗和教訓，這樣才能更好地為臨床和科研服務。隨著科學技術的現(xiàn)代化實現(xiàn)，病理學科也引進了許多自動化裝置，如病理標本的自動脫水機，自動包埋機、自動切片機、自動染色機、自動免疫組化機等。并隨著互聯(lián)網(wǎng)技術的發(fā)展，開展了遠程病理圖文會診，為臨床提供了更便捷、可靠、有效的診斷治療建議。

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