光纖強度篩選

高通量篩選的實驗方法分子水平和細胞水平的實驗方法(或稱篩選模型)是實現(xiàn)藥物高通量篩選的技術(shù)基礎(chǔ)。由于藥物高通量篩選要求同時處理大量樣品，實驗體系必須微量化，而這些微量化的實驗方法應根據(jù)新的科研成果來建立。第四軍醫(yī)大學周四元研究認為，藥物高通量篩選模型的實驗方法，根據(jù)其生物學特點，可分為以下幾類:受體結(jié)合分析法;酶活性測定法;細胞分子測定法;細胞活性測定法;代謝物質(zhì)測定法;基因產(chǎn)物測定法。這些實驗方法，均已廣泛用于藥物高通量篩選中。

高通量篩選的特色效用高通量篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機結(jié)合而形成的一種新技術(shù)體系，它以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù)，以計算機對數(shù)以千計的樣品數(shù)據(jù)進行分析處理，從而得出科學準確的實驗結(jié)果和特色效用。英國學者AlanD研究提示，一個實驗室采用傳統(tǒng)的方法，借助20余種藥物作用靶位，1年內(nèi)僅能篩選75000個樣品;1997年高通量篩選技術(shù)發(fā)展初期，采用100余種靶位，每年可篩選100萬個樣品;1999年高通量篩選技術(shù)進一步完善后，每天的篩選量就高達10萬種化合物。

近年來,光學測定技術(shù)在美、英兩國研究人員在高通量篩選檢測中，努力進行了光學測定方法的研究，建立了大量的非同位素標記測定法，如用分光光度檢測法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活劑等，均獲得成功。

放射性檢測技術(shù)美國學者GanieSM在高通量藥物篩選研究中，應用放射性測定法，特別是親和閃爍(SPA)檢測方法，使在96孔板上進行的樣本量實驗得到發(fā)展。該方法靈敏度高，特異性強，促進了高通量藥物篩選的實現(xiàn)，但存在環(huán)境污染問題。

熒光檢測技術(shù)美國學者GiulianokA研究認為，采用FLIPR(fluorometricimagingreadet)熒光檢測法，可在短時間內(nèi)同時測定熒光的強度和變化，對測定細胞內(nèi)鈣離子流及測定細胞內(nèi)pH和細胞內(nèi)鈉離子流等，是非常理想的一種高效檢測方法。同時采用FDSS(Functional Drug Screening System)進行實時多通道熒光檢測，96微孔板、384微孔板、1536微孔板一次性加樣，實現(xiàn)實時熒光強度信號檢測，可以進行如下應用:

·GPCR calcium influx assays

–All calcium wash or non-washing kits (Fluo-4 or Fura-2 based), Premo? Cameleon, Aequorin

·Ion Channel assays

–FMP, VSP, potassium channel (FluxOR?), sodium channel (SBFI and ANG-2), chloride channel (YFP)

·Enzymatic assays

–Prolyl isomerase, GTPase, Kvb

·Transporter assays

·CytoStar-T

·Circadian clock

·Mosquito Odorant Receptors

·Light activated receptor or channel assays

多功能微板檢測系統(tǒng)由西安交通大學藥學院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測系統(tǒng)，目前是國際上先進的高通量檢測系統(tǒng)，它可使篩選量進一步提高，現(xiàn)已在該院投入使用。

AlphaScreen assay應用廣泛且擁有眾多優(yōu)點，更優(yōu)化藥物篩檢試驗的效果。其操作硬體之限制，導致這實驗方法雖然已研發(fā)數(shù)年，大多數(shù)研究人員并未知曉或廣泛應用它。

化學生物學研究項目的研究重點是在我們的平臺上執(zhí)行的篩選與蛋白質(zhì)相互作用的高通量檢測。為了這個目的，我們采用AlphaScreen assay(Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay)，正如它的名字所暗示的，ALPHA屏是基于發(fā)光接近檢測。

AlphaScreen技術(shù)主要優(yōu)勢在于待測物質(zhì)的范圍寬泛，從小分子到大型復合物;均相體系、快速、穩(wěn)定，靈敏度更高;AlphaScreen檢測也不需要熒光標簽的引入，避免了空間位阻影響生物分子的相互結(jié)合;可用于檢測生物學粗提物例如細胞裂解物、血清、血漿、體液等，而不會影響測讀效果。

AlphaScreen技術(shù)主要的限制在于反應體系對于強光或是長時間的室內(nèi)光敏感;其次，某些化合物對于單體氧分子的捕獲會降低光信號;供體珠光漂白效應使得信號檢測以單次為佳。與ECL、FMAT技術(shù)相似，AlphaScreen也需要高能激光器;同其他技術(shù)相比，AlphaScreen對于檢測儀器平臺有要求。

我國進行藥物高通量篩選的優(yōu)勢首先是化合物來源廣泛，且多為天然;其次是對化合物生物活性的篩選目的較明確，無目的合成的化合物較少;第三，我國傳統(tǒng)藥物為篩選研究提供了一個巨大的資源庫，可從中藥中提取分離篩選新的化合物。這些優(yōu)勢為藥物的高通量篩選打下了堅實基礎(chǔ)。

我國藥物高通量篩選初現(xiàn)規(guī)模:藥物高通量篩選工作在我國起步較晚，且不規(guī)范。近幾年，我國進行了外引內(nèi)聯(lián)的整體化、規(guī)?；A(chǔ)建設，已初見成效。1996年中國醫(yī)學科學院引進國內(nèi)第一臺Bionek2000型實驗自動化工作站;1998年又引進全國第一臺Topcount微量閃爍計數(shù)器，使放射配基實驗、放射免疫實驗等技術(shù)微量化、自動化。上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學科學院分別成立了藥物篩選專門機構(gòu)，開始從事大規(guī)模篩選工作。西安交通大學藥學院賀浪沖教授首創(chuàng)的細胞膜色譜(CMC)為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應的研究，目前正在進行心血管化學合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找。今年將利用分子生物學方法建立CMC自動化篩選體系，促進我國藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展。

高通量篩選技術(shù)，是目前藥物篩選領(lǐng)域研究的重要課題，近年來，對它的研究應用雖然已取得了長足的發(fā)展，但仍然存在許多難題，如體外模型的篩選結(jié)果與整體藥理作用的關(guān)系;對高通量篩選模型的評價標準以及新的藥物作用靶點的研究和發(fā)現(xiàn)等。隨著醫(yī)藥學的進步，高通量篩選技術(shù)在創(chuàng)新藥物的研發(fā)中，一定會開拓出更廣闊的空間。