集聚正能量：懲腐、防腐、廉政管理三步走

一般認為，食品防腐劑對微生物的抑制作用是通過影響細胞亞結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)的，這些亞結(jié)構(gòu)包括細胞壁、細胞膜、與代謝有關(guān)的酶、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)。由于每個亞結(jié)構(gòu)對菌體而言都是必須的，因此食品防腐劑只要作用于其中的一個亞結(jié)構(gòu)便能達到殺菌或抑菌的目的。

在溶液中，弱酸隨pH不同在解離和未解離狀態(tài)間存在動態(tài)平衡。在低pH值情況下該類防腐劑有最大抑菌活性，因為此時分子多數(shù)處于未電離狀態(tài)，未電離的有機弱酸分子是親脂性的，因此可自由透過原生質(zhì)膜。進入細胞內(nèi)后，在高pH環(huán)境下，分子解離成帶電質(zhì)子和陰離子，不易透過膜而在細胞內(nèi)蓄積。防腐劑分子不斷擴散入細胞直到達到平衡，引起細胞內(nèi)H+的失控，改變細胞內(nèi)pH狀態(tài)及蓄積毒性陰離子，抑制細胞的基礎(chǔ)代謝反應，最終達到抑菌目的。

細菌對弱酸的適應性通常是其本身固有的而非誘導產(chǎn)生的。G+菌細胞壁只有肽聚糖層，巨大芽孢桿菌營養(yǎng)細胞的細胞壁可通過30000D的分子，因此，防腐劑極易進入這些細胞內(nèi)部，即細胞固有的適應性也較弱。G-菌的適應性則較復雜，因為它們具有內(nèi)外壁，外壁層(脂多糖層)在控制細胞對防腐劑或其他小分子物質(zhì)的親和性方面起著很關(guān)鍵的作用。

在很多情況下，細菌也可經(jīng)誘導產(chǎn)生適應性，如E.coliO157:H7經(jīng)pH2.0強酸條件處理后誘導其耐酸反應可對苯甲酸產(chǎn)生一定抗性。一些G+菌，如單核細胞增生李斯特菌，在pH5.0溫和酸性條件下放置后，可大大增強其在pH3.0時的耐酸性。推測是細胞有一復雜的耐酸防御系統(tǒng)，使其可在低pH值下存活。

真菌也同樣會對有機弱酸產(chǎn)生適應性。對酵母的適應性研究表明可能細胞膜上的H+-ATP酶和轉(zhuǎn)移子Pdr12起著重要的作用，它們可分別將細胞內(nèi)的H+和防腐劑陰離子排出細胞，從而維持細胞正常的新陳代謝。

在乳中發(fā)現(xiàn)乳過氧化物酶系統(tǒng)對細菌和真菌都有較強抗菌作用，許多G+和G-菌可以被乳過氧化物酶系統(tǒng)抑制，G-通常比G+更敏感。該系統(tǒng)在氫過氧化物和硫氰酸鹽的存在下可發(fā)揮最大活性，過去也將過氧化氫直接加入食品中，但由于對VC破壞太大，現(xiàn)在很少直接用于食品，而多用于包裝材料的滅菌。 在合適的條件下，過氧化氫可產(chǎn)生活性單氧，它有極強的生物致死作用。另外，在分子氧的不完全還原過程中產(chǎn)生的超氧化自由基，與過氧化氫和痕量金屬離子(如Fe2+)協(xié)同作用可產(chǎn)生極具殺傷力的羥基自由基。過氧化氫的抑菌效果與使用濃度、環(huán)境pH、溫度等有關(guān)，例如在室溫下殺芽孢能力很弱，而在高溫時則很有效。過氧化氫對芽孢的殺傷機制還不明確，對真菌和細菌營養(yǎng)細胞的致死性與細胞DNA損傷有關(guān)。

細菌和真菌通過多種途徑保護自身免受氫過氧化物傷害。許多細菌依靠過氧化氫酶降低過氧化氫毒性，但過氧化氫向細胞內(nèi)有很高的擴散速率，少量細胞時，細胞自身的過氧化氫酶沒有足夠的活性來保護細胞，在細胞濃度較高時，過氧化氫酶陽性細胞則可產(chǎn)生足量的酶來保護大多數(shù)細胞免受傷害。細菌芽孢對氫過氧化物的耐受性一般認為是源于芽孢形成過程中合成的α/β酸溶性蛋白的存在，它們可保護休眠狀態(tài)的DNA免受損傷。

酵母細胞有一整套抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、細胞色素、過氧化物酶、硫氧還蛋白、谷氨酰胺半胱氨酸合成酶等。用低濃度過氧化氫處理后，酵母的許多應激系統(tǒng)會被激活，可保護細胞耐受以后更高濃度的過氧化氫。

食品中常用的螯合劑有:檸檬酸鹽、乳酸鹽、焦磷酸鹽和EDTA等，其防腐作用主要是通過與其它防腐劑協(xié)同作用而實現(xiàn)的。對于G-菌，螯合劑起G-外膜滲透劑的作用，EDTA可從G-部分除去含脂多糖的外壁層，還能幫助溶解類脂化合物，特別是脂肪酸，從而增加了其對化學防腐劑的敏感性。對G+菌的抑制作用則主要是由于和金屬離子結(jié)合。當溶液pH下降時EDTA螯合重金屬離子的能力下降，抑菌活性也隨之下降。檸檬酸鹽由于其Ca螯合活性可抑制分解蛋白質(zhì)的C.botulinum的生長。對于真菌，EDTA通過螯合Zn可抑制酵母的生長，推測是阻礙了正常細胞壁的合成。

許多小分子有機物有很好的防腐作用，如肉桂酸、對羥基苯甲酸酯等。實際上，有許多抗菌成分是在植物中天然存在的，牛至、丁香、荔枝等中都可提取到有抗菌作用的物質(zhì)，包括香草酚、阿魏酸、對烯丙基茴香醚、愈創(chuàng)木酚等。這些成分一般為疏水物質(zhì)，能使細胞膜功能紊亂甚至使細胞膜破裂，最終導致微生物死亡。對苯甲酸、肉桂酸和苯甲醛等定量結(jié)構(gòu)活性相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，由反相HPLC測的親脂性參數(shù)與它們抗單核細胞增生李斯特菌性能有顯著關(guān)系。Helander等測試香芹酚、麝香草酚、貢蒿萜酮和肉桂醛等對E.coliO157:H7的效果，他們指出麝香草酚和貢蒿萜酮降低E.Coli胞內(nèi)ATP含量，而同時胞外ATP增加，這可能暗示細胞膜成分已被破壞。 由于許多化合物帶濃烈的風味，使其在食品中的應用受到限制，例如洋蔥和大蒜中的異硫氰酸酯有較強抗菌作用，其衍生物烯丙基異硫氰酸酯和甲基異硫氰酸酯早已作為殺蟲劑在農(nóng)業(yè)上使用了，在食品中則由于其風味問題而妨礙了其應用。對異硫氰酸酯，推測其抗菌活性與通過氧化裂解二硫鍵鈍化細胞外酶有關(guān)，而且反應性硫氰酸鹽自由基可增加抗菌活性。

關(guān)于微生物對這些抗菌成分產(chǎn)生適應性的機制還不很明確，可能是在微生物中存在抗藥性泵可以排除進入微生物的防腐物質(zhì)而保護微生物免受抑制。在G-菌中已知多藥抗性蛋白指令系統(tǒng)包括中性化合物泵(EmrAB)及雙親性陰陽離子泵(AcrAB)，在G+金黃色葡萄球菌中NorA多適應性泵負責排出合成的兩性分子的陽離子化合物如溴乙啡啶及植物來源的抗生素如黃連素和非洲防己堿。

大多數(shù)天然抗菌肽的抑菌作用是由于干擾細胞膜功能，如ceropin和nisin等能在細菌細胞膜上形成電勢依賴通道，導致細胞內(nèi)小分子溢流而使細胞死亡，這些肽的離子通道形成能力是抑制微生物的重要原因。

有的抗菌肽作用的靶結(jié)構(gòu)則為細胞壁。微生物細胞壁對維持微生物細胞生存是特有的和重要的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)不出現(xiàn)在人體中，因此是引起微生物失活最理想的目標。從細胞外降解細菌細胞壁的酶，如溶菌酶，已被用作食品防腐劑。溶菌酶水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，對G+的抗菌活性最強，因為這些細菌細胞壁只有肽聚糖層，容易被水解。 魚精蛋白的作用機制則是抑制線粒體電子傳遞系統(tǒng)的一些特定成分，抑制一些與細胞膜有關(guān)的新陳代謝過程。它可能是定位在膜表面，與膜中那些涉及營養(yǎng)運輸或生物合成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)作用，使這些蛋白質(zhì)功能受損，從而抑制細胞的新陳代謝而使細胞死亡。 微生物同樣會對抗菌肽產(chǎn)生適應性，最主要的原因可能是微生物分泌蛋白酶。推測桿菌對nisin的適應性至少部分是由于其分泌一種可降解nisin的酶，最近又有研究表明細胞質(zhì)外蛋白酶OmpT是E.coli對魚精蛋白有適應性的關(guān)鍵。另一個適應性產(chǎn)生原因可能是防止微生物細胞吸收抗菌肽，Dielbandhoseing等認為焙烤酵母的細胞壁蛋白cwp1和cwp2參與釀酒酵母對nisin和合成兩親抗菌肽的適應性。

此外，在與有膜活性抗菌肽的長期接觸中，細胞可能改變其膜組成，因為不同膜磷脂組成會導致抗菌肽與細胞膜的親和性不同，從而使微生物對藥物的敏感性發(fā)生變化。Verheul等研究發(fā)現(xiàn)對nisin有抗性的單核細胞增生李斯特菌菌株ScottA相對于nisin敏感株有不同的膜磷脂組成，nisin抗性菌株膜中兩性離子磷脂酰乙醇胺有顯著增加，而陰離子二磷酸甘油和心磷脂的含量則降低。

對于作用于細胞壁的抗菌物質(zhì)，微生物同樣也會產(chǎn)生一系列應激反應。經(jīng)過研究酵母細胞如何處理外界酶或其它環(huán)境因素(溫度、pH、水分活度)對細胞壁的破壞作用，發(fā)現(xiàn)酵母細胞可激活一系列酶反應，以檢測細胞壁受到的破壞并將之傳輸?shù)郊毎?，最后增加幾丁質(zhì)合成，促進β-1，3葡聚糖聚合酶(FKS2)的表達，并促進細胞壁蛋白質(zhì)的合成(如cwplp)。Kapteyn等詳述了釀酒酵母的這一系列的應激反應，認為WSC家族的細胞膜定位感受器蛋白質(zhì)參與激活了該應激反應途徑，WSC蛋白本身是應激傳感器或只是在信號傳輸過程中起作用，這個還需要進一步的研究，已知的是如果使WSC蛋白質(zhì)的胞外部分和參與細胞壁組分構(gòu)建的酶失活，將會大大增強防腐劑的作用效果。

綜上所述，各種防腐劑對微生物有不同的作用機制，分別影響不同的細胞亞結(jié)構(gòu)，但同時微生物本身也會對防腐劑產(chǎn)生一系列應激反應而產(chǎn)生適應性。通常，幾種防腐劑協(xié)同作用可產(chǎn)生最佳抑菌效果，例如對G-菌，聯(lián)合應用溶菌酶水解細胞壁、nisin干擾細胞膜以及螯合劑EDTA是很有效的。因此更深入地了解防腐劑在微生物體內(nèi)的作用機理及微生物的應激反應可幫助我們更有效、更合理地使用防腐劑。雖然在這方面已進行了許多研究，但仍然還有許多未闡明的地方，包括微生物是否死亡、殘存、適應環(huán)境或生長以及它們機體內(nèi)發(fā)生了什么生理分子反應機制而導致了這些現(xiàn)象。例如，應激反應過程涉及到哪些信號傳導系統(tǒng)和那些應激蛋白，這些系統(tǒng)是如何聯(lián)系的，每個系統(tǒng)包含多少細胞能量。宏觀的生物能學參數(shù)(生長速率、產(chǎn)量)、微觀生物能學參數(shù)(培養(yǎng)基利用率、ATP水平、ATP/ADP比率、細胞內(nèi)氧化還原平衡)及分子在應激反應中的反應仍是剛興起的研究課題。如果能積累更多的數(shù)據(jù)，用數(shù)學模型來描述微生物生長和死亡，則會比現(xiàn)在食品工業(yè)中實際應用的經(jīng)驗性知識更為科學、準確，對防腐劑的開發(fā)和應用也將有更為科學的指導。