深度蝕刻

取新鮮腎皮質(zhì)組織切成2mm×2mm×4mm小塊。

方法有:①化學(xué)性膜處理法,將組織塊浸入0.02%~0.1%的皂角苷15~30min,皂角苷能溶解脂類物質(zhì),可引起細(xì)胞膜破壞,使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白流出。另外,由于皂角苷也溶解細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu),因而此法僅適用于觀察不含脂質(zhì)的細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)。②物理性膜處理法,將注射器針頭等銳器貼到玻璃片上,對(duì)組織進(jìn)行研磨,破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白流出。本法不破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),適用于觀察細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)。

低濃度戊二醛(0.125%~0.25%)短時(shí)間(15~30min)輕微固定以更好地保存超微結(jié)構(gòu)(此步亦可省略),然后以10%甲醇沖洗30s,防止冷凍時(shí)冰晶形成。

用甘油將標(biāo)本貼敷于標(biāo)本托上,迅速置入異戊烷-丙烷混合液(-193℃)中冷凍。異戊烷-丙烷混合液的配制方法是,先將液氮盛于一較大容器中,然后將盛有異戊烷的玻璃杯放入液氮中冷卻,再將丙烷吹入異戊烷中,丙烷液化而形成異戊烷-丙烷混合液。冷凍后迅速將標(biāo)本移入液氮中,并用冷卻后的手術(shù)刀割斷組織。

將標(biāo)本置入冷凍蝕刻裝置中,在真空度-13300000~-133000000KPa、-95℃條件下蝕刻15~20min,使組織表層(10~20μm)的冰充分升華,顯露出埋在冰中的微細(xì)構(gòu)造。組織細(xì)胞含大量水分,在冷凍過程中形成均勻一致的冰(玻璃化狀態(tài)),組織細(xì)胞的微細(xì)構(gòu)造為這些冰所掩埋。在真空條件下,溫度上升可除去冰,這一過程即蝕刻。蝕刻速度因溫度而不同,-90℃為14nm/s,-110℃為0.02nm/s。以上述條件,蝕刻深度約10μm。蝕刻后的組織表面以37°角旋轉(zhuǎn)噴鍍白金,制取復(fù)型膜,再以90°角噴鍍碳加固復(fù)型膜。

從冷凍蝕刻裝置中取出標(biāo)本,迅速在其表面涂以醋酸戊酯稀釋的2%火棉膠,防止復(fù)型膜破裂。室溫下充分干燥后將標(biāo)本浮于家庭用漂白劑(次亞氯酸鈉)中約1h,溶解掉復(fù)型膜以外的其它組織。然后將復(fù)型膜移至蒸餾水中,沖洗數(shù)次后載到銅網(wǎng)上。室溫下干燥后浸入醋酸戊酯或丙酮中除去火棉膠。

自然干燥后透射電鏡觀察。

用卵白蛋白誘發(fā)大鼠免疫復(fù)合物性腎小球腎炎模型〔6,7〕,取模型組和對(duì)照組大鼠腎臟,按上述方法制取復(fù)型膜,透射電鏡觀察。結(jié)果如圖1~6所示,用QF-DE技術(shù)所觀察到的組織細(xì)胞的三維超微結(jié)構(gòu)不僅清晰逼真,而且可以揭示一些普通電鏡技術(shù)難以揭示的現(xiàn)象。應(yīng)用EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置完全可以做出高質(zhì)量的QF-DE復(fù)型膜。因此,在沒有足夠資金購買新型冷凍蝕刻裝置前,應(yīng)用國內(nèi)現(xiàn)有的EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置探討組織細(xì)胞接近生活狀態(tài)的三維超微結(jié)構(gòu)是可行的。

普通電鏡標(biāo)本制作過程存在的缺點(diǎn)可概括如下:①化學(xué)固定引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)移動(dòng)及微細(xì)構(gòu)造的改變,特別是不可避免地引起以鈉為主的電解質(zhì)及金屬離子的移動(dòng)及流出;②化學(xué)固定引起組織結(jié)構(gòu)變形,如細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架及許多可溶性蛋白質(zhì)相互架橋;③脫水引起脂質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)丟失;④包埋、聚合過程使本來含有多量水分的細(xì)胞陷于過干狀態(tài);⑤透射電鏡觀察需將本來直徑約10μm的立體的細(xì)胞切成0.05~0.1μm的薄片,故電鏡下所看到的不是三維結(jié)構(gòu)而是二維結(jié)構(gòu);⑥醋酸鈾和鉛鹽染色沉淀增加了人工產(chǎn)物。

QF-DE技術(shù)是將含有大量水分的組織細(xì)胞輕微固定,或新鮮標(biāo)本不固定,在液氮中用純銅塊壓迫促其迅速冷凍,或在異戊烷-丙烷混合液中迅速冷凍,使其從組織表面深約10~20μm范圍內(nèi)形成玻璃化狀態(tài)。與以前的冷凍法相比,冷凍速度快,因而稱之為急速冷凍。冷凍后的組織在高真空狀態(tài)下,使溫度上升至100℃左右,目的是將固態(tài)的水分繞過液態(tài)而迅速升華,組織內(nèi)的冰得以消融,遂使細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)外的固有構(gòu)造得以更清楚地暴露出來。這一使存在于細(xì)胞內(nèi)外的冰在真空狀態(tài)下充分升華的過程稱為深度蝕刻。與冷凍蝕刻法相比,QF-DE法有如下特點(diǎn):①不用或少用化學(xué)固定,因而減少人為引起的組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;②冷凍速度快,能捕捉到瞬間的形態(tài)學(xué)變化;③由于不使用防凍劑,蝕刻深,不僅能觀察膜的疏水面,而且能觀察親水性的膜表面及細(xì)胞內(nèi)外的三維超微結(jié)構(gòu)。

QF-DE法是電鏡領(lǐng)域新技術(shù)之一,可用于觀察組織細(xì)胞接近生活狀態(tài)的三維超微結(jié)構(gòu),分辨率高,尤其適用于觀察細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì),具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來,用QF-DE技術(shù)所進(jìn)行的研究,獲得了許多常規(guī)電鏡所無法得到的超微結(jié)構(gòu)新知識(shí)。迄今的研究多用于動(dòng)物組織,期待今后用于人體組織,相信會(huì)得到許多有價(jià)值的資料。

電鏡標(biāo)本制作過程中,人為地引起組織細(xì)胞發(fā)生不少變化,致使在電鏡下看到的超微結(jié)構(gòu),已與其生活狀態(tài)有相當(dāng)差距,而且這些差距隨放大倍率的增高而加大,因而對(duì)組織細(xì)胞的生理構(gòu)造及病理變化所做出的解釋難免有謬誤之處。Heuser等〔1,2〕創(chuàng)立的急速冷凍深度蝕刻(quick-freezinganddeep-etching,簡稱QF-DE)技術(shù)可用于觀察組織細(xì)胞接近生活狀態(tài)的三維超微結(jié)構(gòu),被認(rèn)為是電鏡領(lǐng)域劃時(shí)代的新技術(shù)。國內(nèi)雖早有李向印等關(guān)于快速冷凍復(fù)型技術(shù)的報(bào)道 〔3〕,但之后未見進(jìn)一步的研究報(bào)道。國外均用EikofD-3S以上新型冷凍蝕刻裝置進(jìn)行研究〔4,5〕,而這些裝置價(jià)格昂貴,國內(nèi)尚未引進(jìn)。本文介紹QF-DE技術(shù)并探討應(yīng)用國內(nèi)已有的EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置能否制成QF-DE復(fù)型膜。