葉綠素熒光研究歷史

葉綠素熒光現象是由傳教士Brewster首次發(fā)現的。1834年Brewster發(fā)現當一束強太陽光穿過月桂葉子的乙醇提取液時，溶液的顏色變成了綠色的互補色——紅色，而且顏色隨溶液的厚度而變化，這是歷史上對葉綠素熒光及其重吸收現象的首次記載。后來，Stokes（1852）認識到這是一種光發(fā)射現象，并使用了“fluorescence”一詞。1874年，Müller發(fā)現葉綠素溶液稀釋后，熒光強度比活體葉子的熒光強得多。盡管Müller提出葉綠素熒光和光合作用之間可能存在相反的關系，但由于他的實驗沒有對照，實驗條件控制不嚴格，因此人們并沒有將葉綠素熒光誘導（瞬變）現象的發(fā)現歸功于Müller。

Kautsky是公認的葉綠素熒光誘導現象的發(fā)現者。1931年，Kautsky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素熒光誘導現象(Lichtenthaler，1992；Govindjee，1995)。他們將暗適應的葉子照光后，發(fā)現葉綠素熒光強度隨時間而變化，并與CO2的固定有關（圖3.1）。他們得到的主要結論如下：1）葉綠素熒光迅速升高到最高點，然后下降，最終達到一穩(wěn)定狀態(tài)，整個過程在幾分鐘內完成。2）曲線的上升反映了光合作用的原初光化學反應，不受溫度（0℃和30℃）和HCN處理的影響。若在最高點時關掉光，則熒光迅速下降。3）熒光強度的變化與CO2的固定呈相反的關系，若熒光強度下降，則CO2固定增加。這說明當熒光強度降低時，較多的光能用于轉變成化學能。4）奇怪的是（照光后）CO2的固定有一個延滯期，似乎說明“光依賴”的過程對CO2固定過程的進行是必需的。另一個未得到解釋的現象是若在熒光誘導結束后關掉光，則熒光水平的恢復需要很長時間。在Kautsky的發(fā)現之后，人們對葉綠素熒光誘導現象進行了廣泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用熒光誘導理論，被廣泛應用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出貢獻，葉綠素熒光誘導現象也被稱為Kautsky效應（Kautsky Effect）。

細胞內的葉綠素分子通過直接吸收光量子或間接通過捕光色素吸收光量子得到能量后，從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。由于波長越短能量越高，故葉綠素分子吸收紅光后，電子躍遷到最低激發(fā)態(tài)；吸收藍光后，電子躍遷到比吸收紅光更高的能級（較高激發(fā)態(tài)）。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，在幾百飛秒（fs，1 fs=10－15 s）內，通過振動弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)（圖3.2）。最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒（ns，1 ns=10－9 s）。

處于較低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。能量的釋放方式有如下幾種（圖3.3）（Campbell et al.，1998；Rohá?ek & Barták，1999；Malkin & Niyogi，2000）：1）重新放出一個光子，回到基態(tài)，即產生熒光。由于部分激發(fā)能在放出熒光光子之前以熱的形式逸散掉了，因此熒光的波長比吸收光的波長長，葉綠素熒光一般位于紅光區(qū)。2）不放出光子，直接以熱的形式耗散掉（非輻射能量耗散）。3）將能量從一個葉綠素分子傳遞到鄰近的另一個葉綠素分子，能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后到達反應中心，反應中心葉綠素分子通過電荷分離將能量傳遞給電子受體，從而進行光化學反應。以上這3個過程是相互競爭的，往往是具有最大速率的過程處于支配地位。對許多色素分子來說，熒光發(fā)生在納秒級，而光化學發(fā)生在ps級，因此當光合生物處于正常的生理狀態(tài)時，天線色素吸收的光能絕大部分用來進行光化學反應，熒光只占很小的一部分。

活體細胞內由于激發(fā)能從葉綠素b到葉綠素a的傳遞幾乎達到100%的效率，因此檢測不到葉綠素b熒光。在室溫下，絕大部分（約90%）的活體葉綠素熒光來自PSⅡ的天線色素系統(tǒng)，而且光合器官吸收的能量只有約3%～5%用于產生熒光（林世青，1996；Krause & Weis，1991）。

調制葉綠素熒光全稱脈沖-振幅-調制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）葉綠素熒光，我們國內一般簡稱調制葉綠素熒光，測量調制葉綠素熒光的儀器叫調制熒光儀，或叫PAM。

調制葉綠素熒光（PAM）是研究光合作用的強大工具，與光合放氧、氣體交換并稱為光合作用測量的三大技術。由于其測量快速、簡單、可靠、且測量過程對樣品生長基本無影響，已成為光合作用領域發(fā)表文獻最多的技術。

1983年，WALZ公司首席科學家，德國烏茲堡大學教授Ulrich Schreiber博士利用調制技術和飽和脈沖技術，設計制造了全世界第一臺脈沖振幅調制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調制技術，就是說用于激發(fā)熒光的測量光具有一定的調制（開/關）頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強時。正是由于調制技術的出現，才使得葉綠素熒光由傳統(tǒng)的“黑匣子”（避免環(huán)境光）測量走向了野外環(huán)境光下測量，由生理學走向了生態(tài)學。

所謂飽和脈沖技術，就是打開一個持續(xù)時間很短（一般小于1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，F越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）的強度時，就稱之為飽和脈沖。

打開飽和脈沖時，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，F達到最大值。

經過充分暗適應后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到Fo，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉化為了熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm。根據Fm和Fo可以計算出PS II的最大量子產量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個飽和脈沖，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm’。根據Fm’和F可以求出在照光條件下PSII反應中心部分關閉的情況下的實際原初光能捕獲效率=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物的實際光合效率。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于關閉態(tài)，實時熒光F比Fm要低，也就是說發(fā)生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素熒光和熱。根據能量守恒：1=光合作用 葉綠素熒光 熱?？梢缘贸觯喝~綠素熒光=1－光合作用－熱。也就是說，葉綠素熒光產量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅（photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。

光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑制，也就是說光化學淬滅被全部抑制，但此時熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅系數的計算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

當F達到穩(wěn)態(tài)后關閉光化光，同時打開遠紅光（Far-red Light, FL）（約持續(xù)3－5 s），促進PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時間內回到開放態(tài)，F回到最小熒光Fo附近，此時得到的熒光為Fo’。由于在野外測量Fo’不方便，因此野外版的調制熒光儀（除PAM-2100和WATER-PAM）外，多數不配置遠紅光。此時可以直接利用Fo代替Fo’來計算qP和qN，盡管得到的參數值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢與利用Fo’計算時是一致的。由于NPQ的計算不需Fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應用。

根據PS II的實際量子產量ΔF/Fm’和光合有效輻射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）還可計算出光合電子傳遞的相對速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經驗性吸光系數，0.5是假設植物吸收的光能被兩個光系統(tǒng)均分。

PAM-101/102/103，最經典的型號，雖已停產，但在國際最著名的光合作用實驗室，仍是主打機型，原因很簡單，它老不壞啊。

PAM-2000/PAM-2100，最暢銷的便攜式機型，應用非常廣泛

MINI-PAM，比PAM-2100便宜，功能同樣強大

DIVING-PAM，全球第一臺可水下原位測量植物生理的儀器，儀器全防水設計，在珊瑚研究領域應用非常廣泛

IMAGING-PAM，新型熒光成像系統(tǒng)，最有意思的是一個主機可以連接多個探頭，功能超級強大，是“下一代”產品

DUAL-PAM-100，同步測量葉綠素熒光和P700，也就是同時研究PSII和PSI活性，在技術上有重大革新

等等

為了統(tǒng)一葉綠素熒光參數名稱， 在1990年召開的國際熒光研討會上對上述的大部分參數給出了標準術語( standard nomenclature)。

現常用于分析葉綠素熒光參數的技術稱葉綠素熒光動力學技術，其在測定葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨特的作用，該技術被稱為研究植物光合功能的快速、無損傷探針，已逐漸在環(huán)境脅迫對植物光合作用影響研究方面得到應用。葉綠素熒光技術通常有調制和非調制兩種。調制葉綠素熒光測定技術，是利用具有一定的調制頻率和強度的光源誘導，通過飽和脈沖分析方法，使葉綠素熒光發(fā)射快速地處于某些特定狀態(tài)，以進行相應熒光檢測的技術。即其激發(fā)熒光的測量光具有一定的調制（開/關）頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光；打開一個持續(xù)時間很短（一般小于1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），從而使葉綠素熒光達到最大。該技術方便野外觀測之用。

F0：固定熒光，初始熒光(minimal fluorescence)。也稱基礎熒光，0水平熒光，是光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應 中心處于完全開放時的熒光產量，它與葉片葉綠素濃度有關。

Fm：最大熒光產量(maximal fluorescence)，是PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量?？煞从辰?過PSⅡ的電子傳遞情況。通常葉片經暗適應20 min后測得。

F：任意時間實際熒光產量(actual fluorescence intensity at any time)。

Fa：穩(wěn)態(tài)熒光產量(fluorescence instable state)。

Fm/F0：反映經過PSⅡ的電子傳遞情況。

Fv=Fm-F0：為可變熒光(variable fluorescence)，反映了QA的還原情況。

Fv/Fm：是PSⅡ最大光化學量子產量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSⅡin the dark)或(optimal/maximal quantum yield of PSⅡ)，反映PSⅡ反應中心內稟光能轉換效率(intrinsic PSⅡefficiency)或稱最大PSⅡ的光能轉換效率(optimal/maximalPSⅡefficiency)，葉暗適應20 min后測 得。非脅迫條件下該參數的變化極小，不受物種和生長條件的影響，脅迫條件下該參數明顯下降。

Fv’/Fm’：PSⅡ有效光化學量子產量(photochemical efficiency of PSⅡin the light)，反映開放的PSⅡ反應中心原初光能捕獲效率，葉片不經過暗適應在光下直接測得。

(Fm’-F)/Fm’或△F/Fm’：PSⅡ實際光化學量子產量(actual photochemical efficiency of PSⅡin the light)(Bilger和Bjrkman,1990),它反映PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率,葉片不經過暗適應在光下直接測得。

熒光淬滅分兩種:光化學淬滅和非光化學淬滅。光化學淬滅：以光化學淬滅系數代表：qP=(Fm’-F)/(Fm’-F0’)；非光化學淬滅，有兩種表示方法，NPQ=Fm/Fm’-1或qN=1-(Fm’-F0’)/(Fm-F0)=1-Fv’/Fv。

表觀光合電子傳遞速率以[(Fm’-F)Fm’]×PFD表示，也可寫成：△F/Fm’×PFD×0.5×0.84，其中系數0.5是因為一個電子傳遞需要吸收2個量子，而且光合作用包括兩個光系統(tǒng)，系數0.84表示在入射的光量子中被吸收的占84%，PFD是光子通量密度；表觀熱耗散速率以(1-Fv’/Fm’)×PFD表示。

Fmr：可恢復的最大熒光產量，它的獲得是在熒光P峰和M峰后，當開放的PSⅡ最大熒光產量平穩(wěn)時，關閉作用光得到F0’后，把飽和光的閃光間隔期延長到180s/次，得到一組逐漸增大(對數增長)的最大熒光產量，將該組最大熒光產量放在半對數坐標系中即成直線，該直線在Y軸的截距即為Fmr。以(Fm-Fmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化學淬滅產率，即發(fā)生光抑制的可能程度。