測(cè)試樣品定義

尿液:離心

組織:用柱層析法預(yù)純化。

飼料:酸化，中和離心。

樣品處理需要的時(shí)間:(10個(gè)樣品)

飼料……………………………60分鐘

尿液……………………………10分鐘

組織……………………………6小時(shí)

測(cè)試時(shí)間: 約1小時(shí)

8.1尿樣以2500轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清部分(清亮部分)用于檢測(cè)。若尿樣呈渾濁狀，需先用濾紙過濾，否則會(huì)影響測(cè)定數(shù)值。本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算(采用曲線定量), 與德國(guó)Bio-pharm公司一致。反應(yīng)體系加液量為20μl樣品: 100μl酶液。(見第4頁(yè)尿樣快速檢測(cè)程序)。

8.2.1帶有低脂肪的肝，肉，或組織

…5g粉碎的樣品與25ml 50mM HCL 混合，振蕩1.5小時(shí)，勻漿。

…稱6g勻漿物(相當(dāng)于1g肝臟)，加入離心管中。

…10-15℃以4000轉(zhuǎn)/分或更高速，離心15分鐘

…轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心管中，加300μl 1MNaOH 混合15分鐘。

…加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩沖液(pH3.0)，簡(jiǎn)單的混合后放置4℃至少1.5小時(shí)或過夜。

…10-15℃以4000轉(zhuǎn)/分或更高速，離心15分鐘。分離全部上清液(應(yīng)該是清亮的)，使其升至室溫(20-25℃)，然后用C18柱純化(見C18柱純化步驟)。

8.2.2 肉和組織

…5g 粉碎的樣品與25ml50mM Tris 緩沖液pH8.5混合，振蕩0.5小時(shí)，勻漿。

…加入15ml庚烷(n-heptane)振蕩5分鐘除去脂肪。

…4000g或更高的速度10-15℃離心5分鐘

…用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層

…再用15ml庚烷(n-heptane)重復(fù)步驟2-4

…向勻漿的肉液中加入0.5ml半濃的鹽酸，振蕩1小時(shí)

…稱6g均質(zhì)物(相當(dāng)于1g肝臟)，加入離心管中。

…以下從8.2.1的第一個(gè)離心步驟開始，像處理肝臟一樣繼續(xù)進(jìn)行處理。

C18柱以下列方式純化

所有試劑和樣品處理必須在室溫條件下(20-25℃)并嚴(yán)格控制過柱時(shí)的流速。

…用3ml甲醇(100%)洗滌柱子，流速為1滴/每秒

…用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)

…樣品進(jìn)柱(肝，肉，或組織的全部上清液)

…用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)

…用正壓去除殘留的流體并且用空氣或氮?dú)獯?分鐘干燥柱子

…用2ml甲醇(100%)洗脫樣品，流速為15滴/分鐘

…在50-60℃并且在弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)溶劑

…用1ml蒸流水溶解干燥的殘留物，取50μl進(jìn)行分析

注意:

樣品的保存

…未處理的樣品冷凍保存

…HCL勻漿后的樣品在2-8℃穩(wěn)定3天

…以磷酸二氫鉀緩沖液提取后的樣品(C18柱純化之前)在2-8℃穩(wěn)定2天，使用前需離心。

…C18柱純化步驟6所獲得的甲醇洗脫物可以冷凍保存數(shù)周，在2-8℃穩(wěn)定2周。

…用蒸餾水溶解的干燥殘留物(步驟8)在2-8℃穩(wěn)定1周。

C、操作步驟

本產(chǎn)品的酶標(biāo)記物與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液均直接使用，無(wú)需再稀釋。

1、于適當(dāng)微孔中分別加入100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。

3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標(biāo)記物。

4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1小時(shí)。

5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

8、于室溫下避光靜置溫育20分鐘。

9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。

10、用化學(xué)發(fā)光儀于下判讀。

D、判定

1. 計(jì)算B/B0值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。

3. 根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度。

4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

H、再現(xiàn)性

針對(duì)克倫特羅檢測(cè)試劑盒精密度測(cè)試，重復(fù)6次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(%CV).