復(fù)合Osterix基因的生物玻璃/PCL硬組織工程支架的研究結(jié)題摘要

生物玻璃具有較高的生物活性，與骨結(jié)合強(qiáng)度較強(qiáng)，在人體生理環(huán)境中可以迅速通過(guò)玻璃表面的Na 、Ca2 等元素溶出以及水中H 進(jìn)入玻璃表面，在玻璃表面形成帶有負(fù)電的硅酸凝膠層，進(jìn)一步在生物玻璃表面形成類骨碳酸羥基磷灰石層（Hydroxyl-Carbonate-Apatite, HCA），增強(qiáng)材料界面的細(xì)胞響應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞或其前體-骨祖細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨生成的作用。近幾年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，生物活性玻璃能夠在基因水平調(diào)控細(xì)胞反應(yīng),刺激骨細(xì)胞中某些基因的表達(dá)。利用生物玻璃的這些性質(zhì)，有助于研究開發(fā)出具有刺激、響應(yīng)、介導(dǎo)骨組織自我修復(fù)再生的第三代生物醫(yī)學(xué)材料。如果能夠利用最新的生物醫(yī)學(xué)材料制備及成型加工工藝技術(shù)，結(jié)合基因轉(zhuǎn)染、生物組裝及表面修飾等技術(shù)實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控材料與細(xì)胞之間的相互作用，有可能為骨修復(fù)材料和骨組織工程支架的研究和應(yīng)用提供新的研究思路和方法。 本項(xiàng)目結(jié)合溶膠-凝膠技術(shù)和靜電紡絲技術(shù)制備CaO-P2O5-SiO2三元系統(tǒng)介孔生物玻璃微納米纖維，并以其作為組織工程支架材料的無(wú)機(jī)基相，用于提高材料的力學(xué)強(qiáng)度及生物活性。利用基因重組技術(shù)制備載有骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子Osterix目的基因的質(zhì)粒DNA，并以殼聚糖作為基因表達(dá)載體，制備出包埋有質(zhì)粒 DNA 的殼聚糖納米微球，作為骨修復(fù)材料中的添加相，用以改善材料的細(xì)胞學(xué)特性。配制由生物玻璃微納米纖維、基因載體微球和PCL等材料構(gòu)成的乳液體系，利用熱致相分離法制備復(fù)合Osterix質(zhì)粒DNA的生物玻璃/PCL仿生骨組織工程支架。研究生物玻璃微納米纖維的微細(xì)結(jié)構(gòu)、介孔大小及形貌、分布取向以及質(zhì)粒微球的粒徑尺寸、工藝條件等因素對(duì)材料力學(xué)性能、生物活性、降解速率、離子釋放動(dòng)力學(xué)以及基因調(diào)控特性的影響規(guī)律及機(jī)理。通過(guò)上述研究為仿生骨修復(fù)材料及支架的設(shè)計(jì)與制備提供新的思路和理論依據(jù)。 本課題主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論包括以下幾點(diǎn)： （1）制備出生物相容性好，表面結(jié)構(gòu)及介孔尺寸大小可控的、具有高生物活性的微納米生物玻璃纖維。 （2）建立生物玻璃微納米纖維的離子釋放動(dòng)力學(xué)模型，揭示生物活性材料的微納米結(jié)構(gòu)—物理化學(xué)性質(zhì)—離子釋放動(dòng)力學(xué)-HCA礦化活性之間的關(guān)系。 （3）Osterix基因質(zhì)粒的制備、鑒定及新型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系的建立。 （4）基因介導(dǎo)型復(fù)合骨修復(fù)體細(xì)胞學(xué)性能的研究。

結(jié)合溶膠-凝膠技術(shù)和靜電紡絲技術(shù)制備CaO-P2O5-SiO2三元系統(tǒng)介孔生物玻璃微納米纖維，并以其作為組織工程支架材料的無(wú)機(jī)基相，用于提高材料的力學(xué)強(qiáng)度及生物活性。利用基因重組技術(shù)制備載有骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子Osterix目的基因的質(zhì)粒DNA，并以殼聚糖作為基因表達(dá)載體，制備出包埋有質(zhì)粒 DNA 的殼聚糖納米微球，作為骨修復(fù)材料中的添加相，用以改善材料的細(xì)胞學(xué)特性。配制由生物玻璃微納米纖維、基因載體微球和PCL等材料構(gòu)成的乳液體系，利用熱致相分離法制備復(fù)合OGP質(zhì)粒DNA的生物玻璃/PCL仿生骨組織工程支架。研究生物玻璃微納米纖維的微細(xì)結(jié)構(gòu)、介孔大小及形貌、分布取向以及質(zhì)粒微球的粒徑尺寸、工藝條件等因素對(duì)材料力學(xué)性能、生物活性、降解速率、離子釋放動(dòng)力學(xué)以及基因調(diào)控特性的影響規(guī)律及機(jī)理。通過(guò)上述研究為仿生骨修復(fù)材料及支架的設(shè)計(jì)與制備提供新的思路和理論依據(jù)。

人類的MHC稱為HLA復(fù)合體，，位于第6對(duì)染色體的短臂上長(zhǎng)度為4分摩（centimorgan，cM），約為4000kb。整個(gè)復(fù)合體上有近60個(gè)基因座，已正式命名的等位基因278個(gè)。根據(jù)編碼分子的特性不同，可將整個(gè)復(fù)合體的基因分成三類：Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因（圖6-2）。

基因結(jié)構(gòu)

1．類基因區(qū)位于著絲點(diǎn)的遠(yuǎn)端，主要包括HLA-A、B、C三個(gè)位點(diǎn)；新近又提出E、F、G、H、K和L位點(diǎn)。

2．類基因區(qū)位于著絲點(diǎn)的近端，是結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一個(gè)區(qū)，主要由DR、DQ、DP三個(gè)亞區(qū)構(gòu)成，每個(gè)亞區(qū)又有若干個(gè)位點(diǎn)。新近又鑒定了DO、DZ、DX三個(gè)亞區(qū)。

3．類基因區(qū)含有編碼補(bǔ)體成分C2、C4、B因子及TNF、熱休克蛋白和21羥化酶的基因。

4．非HLA基因這些基因位于HLA區(qū)域內(nèi)，其功能與HLA相關(guān)；目前已經(jīng)命名的有兩類：LMP（largemultifunctionalprotease，或lowmolicularweightpolypeptides）和TAP（transporterassociatedwithantigenprocessing，或transporterofantigenpeptides）。LMP為蛋白酶體相關(guān)基因，由LMP2和LMP7組成；TAP為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，包括TAP1和TAP2；它們的功能可能與抗原的處理和遞呈有關(guān)。

1．單倍型遺傳單倍型

（haplotype）

是指一條染色體上HLA各位點(diǎn)基因緊密連鎖組成的基因單位。人體細(xì)胞為二倍體型，兩個(gè)單倍型分別來(lái)自父親和母親，共同組成個(gè)體的基因型（genotype）。由于一條染色體上HLA各位點(diǎn)的距離非常近，很少發(fā)生同源染色體之間的交換，因此新代的HLA以單倍型為單位將遺傳信息傳給子代。例如父親的基因型為ab，母親的為cd，則子代可能有4種基因型，ac，ad，bc，bd，某一個(gè)體獲得任一基因型的可能性都是1/4。故兩個(gè)同胞有完全相同或完全不同HLA基因型的可能性都是1/4；一個(gè)單倍型相同的可能性是1/2。而子代和親代總是共有一個(gè)相同的單倍型。

2．共顯性遺傳共顯性（co-dominance）

是指某位點(diǎn)的等位基因不論是雜合子還是純合子，均能同等表達(dá)，兩者的編碼產(chǎn)物都可在細(xì)胞表面檢測(cè)到。故每個(gè)位點(diǎn)可具有兩個(gè)抗原，可能相同，也可能不相同；這些抗原組成了個(gè)體的表型（phenotype）。多數(shù)個(gè)體的HLA位點(diǎn)都是雜合子，但當(dāng)父親和母親在某位點(diǎn)上具有相同的等位基因時(shí)，其子代的這個(gè)位點(diǎn)就成為純合子。

3．連鎖不平衡理論

一個(gè)HLA位點(diǎn)的等位基因與另一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的等位基因在某一單倍型出現(xiàn)的頻率應(yīng)等于各自頻率的乘積。然而在很多情況下，預(yù)期的單倍型頻率往往與實(shí)際檢測(cè)的頻率相差很大，在不同的地區(qū)或不同的人群，某些基因相伴出現(xiàn)的頻率特別高，這種現(xiàn)象稱為連鎖不平衡（linkagedisequilibrium）。HLA基因連鎖不平衡的發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些疾病的發(fā)生與HLA復(fù)合體中某些特定的等位基因密切相關(guān)；某些連鎖不平衡傾向于出現(xiàn)在某些區(qū)域、某些人種和某些民族。深入探討連鎖不平衡的發(fā)生機(jī)制無(wú)疑將有助于對(duì)某些疾病的診斷和治療，亦將為人類學(xué)研究增添新的內(nèi)容。

HLA復(fù)合體是人體最復(fù)雜的基因系統(tǒng)，呈高度的多態(tài)性，主要原因之一是由于HLA復(fù)合體的復(fù)等位基因所致。

遺傳學(xué)上將某一個(gè)體同源染色體上對(duì)應(yīng)位置的一對(duì)基因稱為等位基因（alleles）；當(dāng)群體中位于同一位點(diǎn)的等位基因多于兩種時(shí)，稱為復(fù)等位基因（muotiplealleles）。HLA復(fù)合體Ⅰ類和Ⅱ類基因位點(diǎn)多為復(fù)等位基因。1995年公布的用血清學(xué)、MLR和PLT確認(rèn)的HLA特異性見表。

表HLAⅠ類和Ⅰ類基因特異性總表（1995）

ABCDRDQDPD

A1B7B5102Cw1DR1DQ2DPw1Dw1

A2B703B5103Cw2DR103DQ4DPw2Dw2

A203B8B52(5)Cw3DR2DQ5(1)DPw3Dw3

A210B13B53Cw4DR3DQ6(1)DPw4Dw4

A3B15B54(22)Cw5DR4DQ793)DPw5Dw5

A11B18B55(22)Cw6DR7DQ8(3)DPw6Dw6

A23(9)B27B56(22)Cw7DR8DQ9(3)Dw7

A24(9)B35B57(17)Cw8DR9Dw8

A2403B37B58(17)Cw9(w3)DR10Dw9

A25(10)B38(16)B59DR11(5)Dw10

A26(10)B39(16)B60(40)DR12(5)Dw11(w7)

A29(19)B3901B61(40)DR13(6)Dw12

A30(19)B3902B62(15)DR14(6)Dw13

A31(19)B40B63(15)DR1403Dw14

A32(19)B4005B64(14)DR1404Dw15

A33(19)B41B65(14)DR15(2)Dw16

A34(10)B42B67DR16(2)Dw17(w7)

A36B44(12)B70DR17(3)Dw18(w6)

A43B45(12)B71(70)DR18(3)Dw19(w6)

A66(10)B46B72(70)DR51Dw20

A68(28)B47B73DR52Dw21

A69(28)B48B75(15)DR53Dw22

A74(19)B49(21)B76(15)Dw23

B50(21)B77(15)Dw24

B51(5)B7801Dw25

Dw26

HLA抗原的命名由世界衛(wèi)生組織命名委員會(huì)確定，每個(gè)特異性抗原均以其基因位點(diǎn)的字頭附以適當(dāng)?shù)臄?shù)字（按抗原被發(fā)現(xiàn)或官方認(rèn)可的順序）表示。標(biāo)有w（workshop）的為暫用名，得到認(rèn)可后將其去掉；1991年決定：新特異性的申報(bào)要有明確的DNA順序，并根據(jù)DNA間關(guān)系命名，故取消w；現(xiàn)在所保留的w已非當(dāng)初實(shí)驗(yàn)室暫定名的含義，例如保留Cw以示與補(bǔ)體縮寫區(qū)別，保留Dw和DPw以示其用細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)。后面帶括弧的表示該特異性由括弧內(nèi)的特異性分解而來(lái)，括弧內(nèi)為早期確認(rèn)的抗原，包含多個(gè)特異性。表中D抗原不是獨(dú)立基因位點(diǎn)的編碼產(chǎn)物，而是與DR和DQ廣泛相關(guān)，是用細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)的抗原。

表所列特異性是用血清學(xué)方法和細(xì)胞學(xué)方法鑒定出來(lái)的，幾乎每次會(huì)議都命名新的特異性。如此復(fù)雜的基因及產(chǎn)物，再加上單倍體共顯性遺傳的特點(diǎn)，可隨機(jī)組合成一個(gè)巨大的數(shù)字；以致在人群中除同卵雙胎外，難以找到HLA完全相同者。這充分體現(xiàn)了HLA對(duì)免疫調(diào)控的個(gè)體差異，也為同種器官移植增加了困難。

現(xiàn)在用分子生物學(xué)方法可在基因水平上鑒定出更大的HLA多態(tài)性，例如HLA-A2的基因有12個(gè)變異體（A*0201～A*0212），其差別僅在第19密碼子一個(gè)堿基的置換。1994年3月WHO命名委員會(huì)公布的Ⅰ類和Ⅱ類等位基因?yàn)?40個(gè)，1995年1月又發(fā)現(xiàn)了35個(gè)新的基因序列，并對(duì)以前的報(bào)告進(jìn)行了部分修正。