聚丙酰胺凝膠電泳操作步驟

1.必要時(shí)可用KOH/甲醇清洗玻璃板和間隔片。

2.用溫?zé)岬娜ノ蹌┤芤合礈觳ＡО搴烷g隔片，再充分漂洗，先用自來(lái)水，再用去離子水。應(yīng)拿取玻璃的邊緣部分或帶手套操作，以免手上的油脂殘留在玻璃板的工作面上。用乙醇沖洗玻璃板，并將其置于一邊晾干。

3.(可做可不做)其中一塊玻璃板的一面用硅化液處理(如Sigmacote或Acrylease):在化學(xué)通風(fēng)廚內(nèi)，將玻璃板放于一疊紙巾上，倒少量硅化液于其表面上，用Kimwipes紙巾涂抹均勻，然后用去離子水沖洗、紙巾擦干。

4.安裝玻璃與間隔片:

a.將較大的(不帶凹口)玻璃板平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在玻璃板的兩側(cè)將間隔片平行置于其邊緣放妥。

b.用凡士林輕涂以助于間隔片在后面的操作中保持原位。

c.將內(nèi)板(帶凹口的玻璃板)在間隔片上放妥。

d.用夾子或鐵皮制紙夾將玻璃板加在一起，將整塊玻璃的兩邊及底部用凝膠密封帶封緊，形成不透水密封。

5.根據(jù)玻璃板的大小和間隔片的厚度計(jì)算所需凝膠的體積。

6.(可做可不做)將所需用量的聚丙烯酰胺:亞甲雙丙烯酰溶液放于一干凈的帶側(cè)臂的燒瓶中，加入磁力攪拌子，抽真空脫氣。開(kāi)始脫氣應(yīng)溫和一些，并邊脫氣邊旋轉(zhuǎn)燒瓶直至不再有氣泡溢出為止。

灌制凝膠

7.下面的操作需要戴手套，在托盤(pán)上進(jìn)行，以免濺出的丙烯酰胺:亞甲雙丙烯酰溶液灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。動(dòng)作應(yīng)迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。

a.每100ml丙烯酰胺:亞甲雙丙烯酰溶液中加入35μlTEMED，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻溶液。

b.用50ml注射器吸取凝膠溶液，調(diào)轉(zhuǎn)注射器，排凈進(jìn)入針管的空氣。將注射器的針頭插入兩塊玻璃板之間的空隙，注入丙烯酰胺溶液，幾乎注滿改空隙。

c.將玻璃板斜靠在試管架上，與實(shí)驗(yàn)臺(tái)面成約10°角。

8.立即將合適的梳子插到凝膠中，小心勿使梳齒下留有泡。梳子的頂端應(yīng)略高于玻璃板的上沿。用鐵皮制紙夾將梳子夾緊，使其就位。必要時(shí)，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充滿模具。確認(rèn)無(wú)丙烯酰胺溶液從模具漏出。

9.丙烯酰胺于室溫聚合30~60min。若凝膠回縮明顯，應(yīng)補(bǔ)加丙烯酰胺:亞甲雙丙烯酰溶液。

10.聚合完全后，用1×tbe浸潤(rùn)的紙巾包繞梳子和凝膠的頂部。然后用SaranWrap模密封整塊凝膠，4℃保存，直至使用。

11.當(dāng)準(zhǔn)備好進(jìn)行電泳時(shí)，在梳子的周?chē)捌漤敳繃娦?×TBE緩沖液，從聚合的凝膠中小心取出梳子。用注射器吸取1×TBE沖洗加樣孔。用剃須刀或解剖刀除去凝膠底部的密封膠帶。

上樣與電泳

12.將凝膠放入電泳槽中，用大號(hào)鐵皮制夾子夾住其邊緣或用裝置本身的夾子固定。帶凹口的玻璃板應(yīng)面對(duì)緩沖液槽向里面放置。

13.用配制凝膠溶液同一批次的5×TBE配制電泳緩沖液灌滿緩沖液槽。用一根彎頭巴斯德吸管或注射針頭排除藏匿于凝膠底部的氣泡。

14.用巴斯德吸管或注射器再次吸取1×TBE沖洗加樣孔。將DNA樣品與適量6×凝膠載樣緩沖液混合，用Hamilton注射器或帶有拉長(zhǎng)的塑料吸頭的微量移液管加入加樣孔。

15.將電極與電源相連(正極接下槽)，打開(kāi)電源，進(jìn)行電泳。

16.電泳至標(biāo)準(zhǔn)參照染料遷移至所需位置。關(guān)閉電源，拔掉插頭，棄去電泳槽中的電泳緩沖液。

17.卸下玻璃板，用解剖刀或剃須刀片除去凝膠密封膠帶。將玻璃板放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(硅化的玻璃板在上面)。用間隔片或塑料楔將上面的玻璃板的一角翹起。檢查一下凝膠仍應(yīng)附著在下面玻璃板上。將上面的玻璃板平穩(wěn)的移開(kāi)，去掉間隔片。

18.用染色檢測(cè)或放射自顯影檢測(cè)檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠中的DNA條帶的位置。

聚丙酰胺凝膠電泳

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

安裝電泳裝置和配制凝膠溶液