變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

PAM沉淀的技術(shù)流程

沉淀是發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)生成了不溶于反應(yīng)物所在溶液的物質(zhì)。從字意上理解就是在重力作用下沉淀去除。污水中的懸浮物質(zhì)，可以這是一種物理過(guò)程，簡(jiǎn)便易行，效果良好，是污水處理的重要技術(shù)之一。

根據(jù)懸浮物質(zhì)的性質(zhì)、濃度及聚丙烯酰胺絮凝性能，沉淀可以分為:自然沉淀，絮凝沉淀，區(qū)域沉淀。域沉淀的懸浮顆泣濃度較高(5000mg/L以上)，顆粒的沉降受到周圍其它顆粒影響，顆粒間相對(duì)位置保持不變，形成一個(gè)整體共同下沉，與澄清水之間有清晰的泥水界面。二次沉淀池與污泥濃縮池中均有區(qū)域沉淀發(fā)生。

廢水中懸浮固體濃度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉淀過(guò)程中，固體顆粒不改變形狀，也不互相粘合，各自獨(dú)立地完成沉淀過(guò)程，(沉砂池和初沉池的初期沉淀)壓縮沉淀發(fā)生在高濃度懸浮顆粒的沉降過(guò)程中，由于懸浮顆粒濃度很高，顆粒相互之間已擠集成團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，互相接觸，互相支承，下層顆粒間的水在上層顆粒的重力作用下被擠出，使污泥得到濃縮。二沉池污泥斗中的聚丙烯酰胺濃縮過(guò)程以及在濃縮池中污泥的濃縮過(guò)程存在壓縮沉淀。自由沉淀發(fā)生在水中懸浮固體濃度不高，沉淀過(guò)程懸浮固體之間互不干擾，顆粒各自單獨(dú)進(jìn)行沉淀，顆粒的沉淀軌跡呈直線。整個(gè)沉淀過(guò)程中，顆粒的物理性質(zhì)，如形狀，大小及比重等不發(fā)生變化。這種顆粒在沉砂池中的沉淀是自由沉淀。

絮凝沉淀是顆粒物在水中作絮凝沉淀的過(guò)程。在水中投加混凝劑后，其中懸浮物的膠體及分散顆粒在分子力的相互作用下生成絮狀體且在沉降過(guò)程中它們互相碰撞凝聚，其尺寸和質(zhì)量不斷變大，沉速不斷增加。懸浮物的去除率不但取決于沉淀速度，而且與沉淀深度有關(guān)。地面水中投加混凝劑后形成的礬花，生活污水中的有機(jī)懸浮物，活性污泥在沉淀過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)絮凝沉淀的現(xiàn)象。

用途

1. 用于污泥脫水根據(jù)污泥性質(zhì)可選用本產(chǎn)品的相應(yīng)型號(hào)，可有效在污泥進(jìn)入壓濾之前進(jìn)行污泥脫水，脫水時(shí)，產(chǎn)生絮團(tuán)大，不粘濾布，壓濾時(shí)不散，流泥餅較厚，脫水效率高，泥餅含水率在80%以下。

2. 用于生活污水和有機(jī)廢水的處理，本產(chǎn)品在配性或堿性介質(zhì)中均呈現(xiàn)陽(yáng)電性，這樣對(duì)污水中懸浮顆粒帶陰電荷的污水進(jìn)行絮凝沉淀，澄清很有效。如生產(chǎn)糧食酒精廢水，造紙廢水，城市污水處理廠的廢水，啤酒廢水，味精廠廢水，制糖廢水，有機(jī)含量高 廢水、飼料廢水，紡織印染廢水等，用陽(yáng)離子聚丙烯酰胺要比用陰離子、非離子聚丙烯酰胺或無(wú)機(jī)鹽類效果要高數(shù)倍或數(shù)十倍，因?yàn)檫@類廢水普遍帶陰電荷。

3. 用于以江河水作水源的自來(lái)水的處理絮凝劑，用量少，效果好，成本低，特別是和無(wú)機(jī)絮凝劑復(fù)合使用效果更好，它將成為治長(zhǎng)江、黃河及其它流域的自來(lái)水廠的高效絮凝劑。

4. 造紙用增強(qiáng)劑及其它助劑。提高填料、顏料等存留率、紙張的強(qiáng)度。

5. 用于油田經(jīng)學(xué)助劑，如粘土防膨劑，油田酸化用稠化劑。

6. 用于紡織上漿劑、漿液性能穩(wěn)定、落漿少、織物斷頭率低、布面光潔。

非變性凝膠里面沒(méi)加變性劑，一般是SDS。非變性膠跑出來(lái)的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗(yàn)，如EMSA。由于沒(méi)有變性劑的原因非變性膠電泳時(shí)除了與蛋白分子量有關(guān)也會(huì)受都電荷的影響，因此對(duì)蛋白等電點(diǎn)的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時(shí)需要倒轉(zhuǎn)電泳時(shí)的正負(fù)極。從跑的膠來(lái)看，變性膠會(huì)比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來(lái)則比較粗糙。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是根據(jù)寡核苷酸的大小來(lái)分離，因此可將全長(zhǎng)產(chǎn)物與不完整的短分子分開。電泳時(shí)通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，電泳后在紫外燈下定位寡核苷酸條帶，將長(zhǎng)度正確的寡核苷酸從凝膠上切下。

凝膠的制備:

凝膠由分離膠和濃縮膠組成:上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，其pH為6.8，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動(dòng)中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，pH為8.8，變性蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷基本一致，泳動(dòng)速度主要決定于分子量。

制備順序?yàn)橄裙嘀品蛛x膠，然后在分離膠上灌制濃縮膠: (四人一組)

1. 在兩塊玻璃板間夾以墊條，用手夾住玻璃板放入電泳槽主體內(nèi)，缺口朝外，再插入斜楔板。

2. 拿一小燒杯，按下表加入各試劑: (12%分離膠)

3. 上述溶液混勻后，用滴管迅速加入兩玻璃板間，灌注高度為紅色背景下沿線。然后滴上少量水飽和異丁醇，靜置約15分鐘。

4. 待凝膠與異丁醇出現(xiàn)分層時(shí)，倒去異丁醇，用洗瓶沖洗凝膠頂部，然后拿一燒杯，按下表加入各試劑: (4%濃縮膠)

5. 上述溶液混勻后，用滴管迅速加入已制好分離膠的玻璃板間，灌滿后，小心插入梳子，靜置30分鐘。

6. 待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉墊條后，缺口朝內(nèi)放入電泳槽主體，插入斜楔板。 兩組用一個(gè)電泳槽主體，兩組玻璃板間即為上槽。

7. 裝好的電泳槽主體放入下槽，往上下槽加入 Tris-甘氨酸電極緩沖液。用滴管沖洗凝膠頂部，并趕走底層的氣泡。

樣品制備

蛋白質(zhì)樣品需變性并結(jié)合SDS，形成所帶負(fù)電荷相對(duì)一致的非折疊衍生物。四人一組，取一1.5離心管，加入30ul鼠IgG樣品和30ul樣品緩沖液，混勻后沸水浴5分鐘，3000rpm離心數(shù)秒，每人取10ul加樣。

電泳

連接電泳儀，選擇電壓為40伏，藍(lán)色指示劑移動(dòng)至凝膠底部即停止電泳。取出玻璃板，用保鮮膜包好，置冰箱待明日做蛋白印漬(Western-Blotting)。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等變性劑的條件下，對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同 工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過(guò)程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性SDS-PAGE電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。 酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)向陽(yáng)極移動(dòng);而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳分離堿性蛋白。

1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過(guò)程中，蛋白質(zhì)的遷移率不僅和蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有關(guān)，還和蛋白質(zhì)的分子量以及分子形狀有關(guān)，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是最重要的影響因子，要根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來(lái)選擇對(duì)應(yīng)的電泳緩沖系統(tǒng);

2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過(guò)程中，要注意電壓過(guò)高引起發(fā)熱而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度;

3. 蛋白質(zhì)的分子量較大，則電泳時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)，以使目的蛋白質(zhì)有足夠的遷移率和其它的蛋白質(zhì)分開，反之亦然;

4. 變性樣品的離子強(qiáng)度不能太高(I<0.1mM)。上樣buffer中沒(méi)有SDS之外，加入樣品后不能加熱。