辣根過氧化物酶

過氧化物酶，酶學分類號為EC 1.11.1.7。

Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O。

辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP) 比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000，等電點為PH3~9，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。

1) RZ>3 活性 >250u/mg， 主要應用于免疫學，是高純度的過氧化酶。采用特殊色譜純化技術(shù)以除去會影響免疫學反應的同工酶B .

2) RZ>2 活性 >180u/mg ，主要應用于臨床化學，我們的客戶也有將這個規(guī)格的產(chǎn)品應用于免疫學研究的。此時，一個標準化的分析方法就變得尤為重要。

3) RZ>1 活性 >100u/mg，主要應用于血糖試紙和尿液分析試紙。

4) RZ>0.6 活性 >60u/mg ，主要應用于尿液分析試紙。

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由無色酶蛋白和深棕色鐵卟啉(輔基)構(gòu)成一種糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。

HRP分子量較小(40kDa)，標記物容易穿透入細胞內(nèi)部;作用底物為H2O2，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為供氫體的反應產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察;在pH3.5~12范圍內(nèi)穩(wěn)定，對熱及有機溶劑的作用亦較穩(wěn)定，能耐受63℃加熱15min;用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性;溶解性好，100mL緩沖鹽溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級沉淀法分離純化;氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對HRP的活性有抑制作用，應避免使用NaN3作為酶標試劑的防腐劑，以防止失活。

凡能在HRP和H2O2存在時被酶催化H2O2反應而和成有色產(chǎn)物的化合物(供氫體)都可以用顯色劑。供氫體的產(chǎn)物分不溶性和可溶性兩類。前者最常用的為3，3'二氨基聯(lián)苯胺(3,3'diaminobenzidine,DAB)，適用于免疫組化法;反應后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產(chǎn)物，適用電鏡檢查;此外還有飽和聯(lián)苯胺溶液，氧化后產(chǎn)物呈黃褐色，多用于酶免疫擴散的深沉線顯色。后者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，產(chǎn)物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm，可用肉眼判別;易被濃酸終止反應，顏色可數(shù)小時不變，是ELISA中最常用的一種;但對光敏感，使用時要避光，并發(fā)現(xiàn)有致癌作用。

用HRP標記抗體需借助交聯(lián)劑的作用，將酶連接在抗體分子上。常用的交聯(lián)劑為過碘酸鈉和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。

HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應發(fā)生自身偶聯(lián)，在標記前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應后，再加入硼氫化鈉(NaHB4)還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。

[標記步驟]

(1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)無水乙醇溶液0.1mL，室溫(20℃±)下輕微攪拌作用1h。

(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色。

(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室溫(20℃±)下輕攪作用1 h，終止氧化反應。

(4)加入5mg抗體(Ig)，裝入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液(無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g,蒸餾水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析過夜，更換3次。

(5)取出透析袋中液體(約3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或過夜。

(6)加50%飽和硫酸銨(NH4)2SO4溶液(硫酸銨850g，蒸餾水加至1 000 mL，以30%氨水調(diào)pH7.2)6 mL沉淀結(jié)合物，置4℃30min后，3 000r/min離心30min，取深沉(SPA不需要進行此步)。

(7)將沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h，換液3次。

(8)在結(jié)合物內(nèi)加入BSA至蛋白濃度為10mg/ mL，或加等量60%甘油，測定工作效價后，小量分裝(或凍干，不需加甘油)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，通過它的兩個醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結(jié)合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結(jié)合物。反應可在4-40℃溫度范圍，pH6.0~8.0 的緩沖溶液中進行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標記抗體混合，同時加入戊二醛進行交聯(lián)反應。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結(jié)合物，結(jié)過透析或?qū)游龀ノ唇Y(jié)合的戊二醛，然后再與抗體結(jié)合。

[標記步驟]

(1)取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB將25%戊二醛稀釋為1.25%)，室溫(20℃左右)反應結(jié)合18h。

(2)用0.15mol/LNaCl平衡過的Sephadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析過夜。

(3)將5mg抗體IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再與醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。

(4)加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)pH至9.0~9.6)，4℃，電磁攪拌下結(jié)合24h。

(5)加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸(0.29g溶于10mL蒸餾水)，4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應。

(6)裝入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析過夜，或通過Sephadex G-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液，加入等量60%甘油，測工作效價后，小量分裝，4℃或-20℃保存。

酶促反應的發(fā)光底物

酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目前化學發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。HRP的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物和對-羥基苯乙酸。AP的發(fā)光底物為3-(2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)和4-甲基傘形酮磷酸鹽(4-MUP，熒光底物)。

(1).魯米諾或其衍生物。 魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris緩沖液作底物液。要注意是:首先,魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP發(fā)光增強劑如某些酚試劑(如鄰-碘酚)或螢火蟲熒光素酶可增強HRP催化魯米諾氧化的反應和延長發(fā)光時間，提高發(fā)光敏感度。

(2).對-羥基苯乙酸(HPA)。 對-羥基苯乙酸(HPA)在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚體(熒光物質(zhì))，在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。

(3).AMPPD。 AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15-60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。

(4)4-MUP。 4-MUP被ALP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，用熒光光度計進行測量。

直接化學發(fā)光劑

直接化學發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)，如吖啶酯(acridinium, AE)在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。

電化學發(fā)光劑

電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+(圖16-7)和電子供體三丙胺(TPA)在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。二價的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價，成為強氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個質(zhì)子(H+)，形成自由基TPA.，成為一種很強的還原劑，可將一個高能量的電子遞給三價的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個波長為620nm的光子，回復到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過程可在電極表面周而復始地進行，產(chǎn)生許多光子，使光信號增強。