page分離技術(shù)

PAGE為Polyacylamide Gel Electrophoresis的簡(jiǎn)寫(xiě)即聚丙烯酰胺凝膠電泳，是一種常用的分離技術(shù)。

1.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(以后簡(jiǎn)稱(chēng)單體)在水溶液中聚合而成的親水性高聚物，是一種透明而不溶于水并有韌性的凝膠。

2.制備凝膠時(shí)需要的原料是:丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺(雙體，用作交聯(lián)劑)o在水溶液中用催化劑引發(fā)聚合。常用的催化劑有:二甲氨基丙腈(DMAPN);過(guò)硫酸銨，四甲基乙二胺;過(guò)硫酸銨或加核黃素后用紫外光(波長(zhǎng) 253.7毫微米)引發(fā)聚合。

3.聚合時(shí)丙烯酰胺分子通過(guò)加成反應(yīng)形成長(zhǎng)鏈，雙體的作用是在長(zhǎng)鏈之間形成交聯(lián)，成為具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠(見(jiàn)圖1)。所以在凝膠電泳中除了具有電泳的分離外還具有分子篩作用，從而增高了它的分辨能力。

4.聚合時(shí)，根據(jù)分離的需要，可以用改變單體溶液濃度或增減雙體比例的辦法制成孔度大小不同的凝膠。在分離血清蛋白時(shí)，我們采用的丙烯酰胺總濃度為6.5%，內(nèi)含單體96%，雙休4 5{芻(T一6.5，c一4%)。

5.聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性。能在水中溶脹但不溶解。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳操作流程

1.將玻片裝置搭建起來(lái)，加水靜置，檢查是否有滲漏。

2.配制分離膠 加入2玻片間，加時(shí)盡量減少氣泡，由玻片一端連續(xù)、快速、均勻的注入，可適當(dāng)搖晃，使得分離膠上界面盡量水平;加保護(hù)液(0.1% SDS)靜置凝聚。加保護(hù)液時(shí)，槍頭應(yīng)均勻掃過(guò)玻片上沿，切不可由一端注入。

3.配制濃縮膠 待分離膠凝固后，去除保護(hù)液，依同樣方法加入上層濃縮膠，并插入梳齒模具，靜置。插入模具后，加少許濃縮膠，補(bǔ)平液面 。

4.配制電泳緩沖液，濃縮膠凝固后，玻片取下，放入電泳槽中，有凹陷玻片朝向內(nèi)側(cè)，并將玻片用夾子夾緊，在外側(cè)玻片粘上凹槽指示薄片，取下梳齒，加入電泳緩沖液，平板內(nèi)側(cè)液面以剛沒(méi)過(guò)凹槽上沿為宜。

5.樣品處理 將待分析樣品配制成合適的濃度或濃度梯度溶液，連同marker分裝于Ep管中，并加入loading buffer ，100℃煮沸。此步可調(diào)至步驟3后做，一般4完成后不宜等待過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，最好立即加樣、通電。

6.將樣品液依次加入梳齒形膠孔中，每孔上樣量10ul。

7.接通電源，設(shè)為恒流10 mA，待樣品跑至分離膠界面后，調(diào)整電流為15 mA。

8.膠跑完后，固定(0.5h~)、染色(1.5h~)、脫色。

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。 SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開(kāi)始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開(kāi)始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過(guò)蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。

此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。

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