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調(diào)制葉綠素?zé)晒馊Q脈沖-振幅-調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）葉綠素?zé)晒?，我們?guó)內(nèi)一般簡(jiǎn)稱調(diào)制葉綠素?zé)晒猓瑴y(cè)量調(diào)制葉綠素?zé)晒獾膬x器叫調(diào)制熒光儀，或叫PAM。

調(diào)制葉綠素?zé)晒猓≒AM）是研究光合作用的強(qiáng)大工具，與光合放氧、氣體交換并稱為光合作用測(cè)量的三大技術(shù)。由于其測(cè)量快速、簡(jiǎn)單、可靠、且測(cè)量過程對(duì)樣品生長(zhǎng)基本無(wú)影響，已成為光合作用領(lǐng)域發(fā)表文獻(xiàn)最多的技術(shù)。

1983年，WALZ公司首席科學(xué)家，德國(guó)烏茲堡大學(xué)教授Ulrich Schreiber博士利用調(diào)制技術(shù)和飽和脈沖技術(shù)，設(shè)計(jì)制造了全世界第一臺(tái)脈沖振幅調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調(diào)制技術(shù)，就是說用于激發(fā)熒光的測(cè)量光具有一定的調(diào)制（開/關(guān)）頻率，檢測(cè)器只記錄與測(cè)量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測(cè)量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強(qiáng)時(shí)。正是由于調(diào)制技術(shù)的出現(xiàn)，才使得葉綠素?zé)晒庥蓚鹘y(tǒng)的“黑匣子”（避免環(huán)境光）測(cè)量走向了野外環(huán)境光下測(cè)量，由生理學(xué)走向了生態(tài)學(xué)。

所謂飽和脈沖技術(shù)，就是打開一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短（一般小于1 s）的強(qiáng)光關(guān)閉所有的電子門（光合作用被暫時(shí)抑制），從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個(gè)特例。光化光越強(qiáng)，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關(guān)閉態(tài)的電子門越多，F(xiàn)越高。當(dāng)光化光達(dá)到使所有的電子門都關(guān)閉（不能進(jìn)行光合作用）的強(qiáng)度時(shí)，就稱之為飽和脈沖。

打開飽和脈沖時(shí)，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔幔現(xiàn)達(dá)到最大值。

經(jīng)過充分暗適應(yīng)后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測(cè)量光得到Fo，此時(shí)給出一個(gè)飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m。根據(jù)Fm和Fo可以計(jì)算出PS II的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個(gè)飽和脈沖，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔?，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m’。根據(jù)Fm’和F可以求出在照光條件下PSII反應(yīng)中心部分關(guān)閉的情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物的實(shí)際光合效率。

在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門處于關(guān)閉態(tài)，實(shí)時(shí)熒光F比Fm要低，也就是說發(fā)生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素?zé)晒夂蜔?。根?jù)能量守恒：1=光合作用 葉綠素?zé)晒?熱?？梢缘贸觯喝~綠素?zé)晒?1－光合作用－熱。也就是說，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學(xué)淬滅（photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學(xué)淬滅（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化學(xué)淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學(xué)淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護(hù)能力。

光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時(shí)，電子門被完全關(guān)閉，光合作用被暫時(shí)抑制，也就是說光化學(xué)淬滅被全部抑制，但此時(shí)熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學(xué)淬滅。淬滅系數(shù)的計(jì)算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

當(dāng)F達(dá)到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光，同時(shí)打開遠(yuǎn)紅光（Far-red Light, FL）（約持續(xù)3－5 s），促進(jìn)PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時(shí)間內(nèi)回到開放態(tài)，F(xiàn)回到最小熒光Fo附近，此時(shí)得到的熒光為Fo’。由于在野外測(cè)量Fo’不方便，因此野外版的調(diào)制熒光儀（除PAM-2100和WATER-PAM）外，多數(shù)不配置遠(yuǎn)紅光。此時(shí)可以直接利用Fo代替Fo’來計(jì)算qP和qN，盡管得到的參數(shù)值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢(shì)與利用Fo’計(jì)算時(shí)是一致的。由于NPQ的計(jì)算不需Fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

根據(jù)PS II的實(shí)際量子產(chǎn)量ΔF/Fm’和光合有效輻射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）還可計(jì)算出光合電子傳遞的相對(duì)速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經(jīng)驗(yàn)性吸光系數(shù)，0.5是假設(shè)植物吸收的光能被兩個(gè)光系統(tǒng)均分。

葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象是由傳教士Brewster首次發(fā)現(xiàn)的。1834年Brewster發(fā)現(xiàn)當(dāng)一束強(qiáng)太陽(yáng)光穿過月桂葉子的乙醇提取液時(shí)，溶液的顏色變成了綠色的互補(bǔ)色——紅色，而且顏色隨溶液的厚度而變化，這是歷史上對(duì)葉綠素?zé)晒饧捌渲匚宅F(xiàn)象的首次記載。后來，Stokes（1852）認(rèn)識(shí)到這是一種光發(fā)射現(xiàn)象，并使用了“fluorescence”一詞。1874年，Müller發(fā)現(xiàn)葉綠素溶液稀釋后，熒光強(qiáng)度比活體葉子的熒光強(qiáng)得多。盡管Müller提出葉綠素?zé)晒夂凸夂献饔弥g可能存在相反的關(guān)系，但由于他的實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)照，實(shí)驗(yàn)條件控制不嚴(yán)格，因此人們并沒有將葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)（瞬變）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)歸功于Müller。

Kautsky是公認(rèn)的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)者。1931年，Kautsky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象(Lichtenthaler，1992；Govindjee，1995)。他們將暗適應(yīng)的葉子照光后，發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間而變化，并與CO2的固定有關(guān)（圖3.1）。他們得到的主要結(jié)論如下：1）葉綠素?zé)晒庋杆偕叩阶罡唿c(diǎn)，然后下降，最終達(dá)到一穩(wěn)定狀態(tài)，整個(gè)過程在幾分鐘內(nèi)完成。2）曲線的上升反映了光合作用的原初光化學(xué)反應(yīng)，不受溫度（0℃和30℃）和HCN處理的影響。若在最高點(diǎn)時(shí)關(guān)掉光，則熒光迅速下降。3）熒光強(qiáng)度的變化與CO2的固定呈相反的關(guān)系，若熒光強(qiáng)度下降，則CO2固定增加。這說明當(dāng)熒光強(qiáng)度降低時(shí)，較多的光能用于轉(zhuǎn)變成化學(xué)能。4）奇怪的是（照光后）CO2的固定有一個(gè)延滯期，似乎說明“光依賴”的過程對(duì)CO2固定過程的進(jìn)行是必需的。另一個(gè)未得到解釋的現(xiàn)象是若在熒光誘導(dǎo)結(jié)束后關(guān)掉光，則熒光水平的恢復(fù)需要很長(zhǎng)時(shí)間。在Kautsky的發(fā)現(xiàn)之后，人們對(duì)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用熒光誘導(dǎo)理論，被廣泛應(yīng)用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出貢獻(xiàn)，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象也被稱為Kautsky效應(yīng)（Kautsky Effect）。

細(xì)胞內(nèi)的葉綠素分子通過直接吸收光量子或間接通過捕光色素吸收光量子得到能量后，從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。由于波長(zhǎng)越短能量越高，故葉綠素分子吸收紅光后，電子躍遷到最低激發(fā)態(tài)；吸收藍(lán)光后，電子躍遷到比吸收紅光更高的能級(jí)（較高激發(fā)態(tài)）。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，在幾百飛秒（fs，1 fs=10－15 s）內(nèi)，通過振動(dòng)弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)（圖3.2）。最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒（ns，1 ns=10－9 s）。

處于較低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。能量的釋放方式有如下幾種（圖3.3）（Campbell et al.，1998；Rohá?ek & Barták，1999；Malkin & Niyogi，2000）：1）重新放出一個(gè)光子，回到基態(tài)，即產(chǎn)生熒光。由于部分激發(fā)能在放出熒光光子之前以熱的形式逸散掉了，因此熒光的波長(zhǎng)比吸收光的波長(zhǎng)長(zhǎng)，葉綠素?zé)晒庖话阄挥诩t光區(qū)。2）不放出光子，直接以熱的形式耗散掉（非輻射能量耗散）。3）將能量從一個(gè)葉綠素分子傳遞到鄰近的另一個(gè)葉綠素分子，能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后到達(dá)反應(yīng)中心，反應(yīng)中心葉綠素分子通過電荷分離將能量傳遞給電子受體，從而進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)。以上這3個(gè)過程是相互競(jìng)爭(zhēng)的，往往是具有最大速率的過程處于支配地位。對(duì)許多色素分子來說，熒光發(fā)生在納秒級(jí)，而光化學(xué)發(fā)生在ps級(jí)，因此當(dāng)光合生物處于正常的生理狀態(tài)時(shí)，天線色素吸收的光能絕大部分用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，熒光只占很小的一部分。

活體細(xì)胞內(nèi)由于激發(fā)能從葉綠素b到葉綠素a的傳遞幾乎達(dá)到100%的效率，因此檢測(cè)不到葉綠素b熒光。在室溫下，絕大部分（約90%）的活體葉綠素?zé)晒鈦碜訮SⅡ的天線色素系統(tǒng)，而且光合器官吸收的能量只有約3%～5%用于產(chǎn)生熒光（林世青，1996；Krause & Weis，1991）。

PAM-101/102/103，最經(jīng)典的型號(hào)，雖已停產(chǎn)，但在國(guó)際最著名的光合作用實(shí)驗(yàn)室，仍是主打機(jī)型，原因很簡(jiǎn)單，它老不壞啊。

PAM-2000/PAM-2100，最暢銷的便攜式機(jī)型，應(yīng)用非常廣泛

MINI-PAM，比PAM-2100便宜，功能同樣強(qiáng)大

DIVING-PAM，全球第一臺(tái)可水下原位測(cè)量植物生理的儀器，儀器全防水設(shè)計(jì)，在珊瑚研究領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛

IMAGING-PAM，新型熒光成像系統(tǒng)，最有意思的是一個(gè)主機(jī)可以連接多個(gè)探頭，功能超級(jí)強(qiáng)大，是“下一代”產(chǎn)品

DUAL-PAM-100，同步測(cè)量葉綠素?zé)晒夂蚉700，也就是同時(shí)研究PSII和PSI活性，在技術(shù)上有重大革新

等等

為了統(tǒng)一葉綠素?zé)晒鈪?shù)名稱， 在1990年召開的國(guó)際熒光研討會(huì)上對(duì)上述的大部分參數(shù)給出了標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)( standard nomenclature)。

現(xiàn)常用于分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)的技術(shù)稱葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)，其在測(cè)定葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用，該技術(shù)被稱為研究植物光合功能的快速、無(wú)損傷探針，已逐漸在環(huán)境脅迫對(duì)植物光合作用影響研究方面得到應(yīng)用。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)通常有調(diào)制和非調(diào)制兩種。調(diào)制葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定技術(shù)，是利用具有一定的調(diào)制頻率和強(qiáng)度的光源誘導(dǎo)，通過飽和脈沖分析方法，使葉綠素?zé)晒獍l(fā)射快速地處于某些特定狀態(tài)，以進(jìn)行相應(yīng)熒光檢測(cè)的技術(shù)。即其激發(fā)熒光的測(cè)量光具有一定的調(diào)制（開/關(guān)）頻率，檢測(cè)器只記錄與測(cè)量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測(cè)量所有生理狀態(tài)下的熒光；打開一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短（一般小于1 s）的強(qiáng)光關(guān)閉所有的電子門（光合作用被暫時(shí)抑制），從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大。該技術(shù)方便野外觀測(cè)之用。

F0：固定熒光，初始熒光(minimal fluorescence)。也稱基礎(chǔ)熒光，0水平熒光，是光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng) 中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量，它與葉片葉綠素濃度有關(guān)。

Fm：最大熒光產(chǎn)量(maximal fluorescence)，是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量?？煞从辰?jīng) 過PSⅡ的電子傳遞情況。通常葉片經(jīng)暗適應(yīng)20 min后測(cè)得。

F：任意時(shí)間實(shí)際熒光產(chǎn)量(actual fluorescence intensity at any time)。

Fa：穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量(fluorescence instable state)。

Fm/F0：反映經(jīng)過PSⅡ的電子傳遞情況。

Fv=Fm-F0：為可變熒光(variable fluorescence)，反映了QA的還原情況。

Fv/Fm：是PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSⅡin the dark)或(optimal/maximal quantum yield of PSⅡ)，反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率(intrinsic PSⅡefficiency)或稱最大PSⅡ的光能轉(zhuǎn)換效率(optimal/maximalPSⅡefficiency)，葉暗適應(yīng)20 min后測(cè) 得。非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小，不受物種和生長(zhǎng)條件的影響，脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。

Fv’/Fm’：PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(photochemical efficiency of PSⅡin the light)，反映開放的PSⅡ反應(yīng)中心原初光能捕獲效率，葉片不經(jīng)過暗適應(yīng)在光下直接測(cè)得。

(Fm’-F)/Fm’或△F/Fm’：PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量(actual photochemical efficiency of PSⅡin the light)(Bilger和Bjrkman,1990),它反映PSⅡ反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率,葉片不經(jīng)過暗適應(yīng)在光下直接測(cè)得。

熒光淬滅分兩種:光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅。光化學(xué)淬滅：以光化學(xué)淬滅系數(shù)代表：qP=(Fm’-F)/(Fm’-F0’)；非光化學(xué)淬滅，有兩種表示方法，NPQ=Fm/Fm’-1或qN=1-(Fm’-F0’)/(Fm-F0)=1-Fv’/Fv。

表觀光合電子傳遞速率以[(Fm’-F)Fm’]×PFD表示，也可寫成：△F/Fm’×PFD×0.5×0.84，其中系數(shù)0.5是因?yàn)橐粋€(gè)電子傳遞需要吸收2個(gè)量子，而且光合作用包括兩個(gè)光系統(tǒng)，系數(shù)0.84表示在入射的光量子中被吸收的占84%，PFD是光子通量密度；表觀熱耗散速率以(1-Fv’/Fm’)×PFD表示。

Fmr：可恢復(fù)的最大熒光產(chǎn)量，它的獲得是在熒光P峰和M峰后，當(dāng)開放的PSⅡ最大熒光產(chǎn)量平穩(wěn)時(shí)，關(guān)閉作用光得到F0’后，把飽和光的閃光間隔期延長(zhǎng)到180s/次，得到一組逐漸增大(對(duì)數(shù)增長(zhǎng))的最大熒光產(chǎn)量，將該組最大熒光產(chǎn)量放在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系中即成直線，該直線在Y軸的截距即為Fmr。以(Fm-Fmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化學(xué)淬滅產(chǎn)率，即發(fā)生光抑制的可能程度。