隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷進(jìn)步，大規(guī)模修飾組學(xué)的方法也越來(lái)越成熟，PTM作為生物體內(nèi)非常重要的生理現(xiàn)象也逐步被揭示出參與各項(xiàng)生命活動(dòng)。今天我們就一起來(lái)學(xué)習(xí)一篇運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)磷酸化修飾和類泛素化修飾鑒定，找出兩種修飾聯(lián)合作用對(duì)在DNA復(fù)制損傷壓力時(shí)的響應(yīng)。該篇文獻(xiàn)來(lái)自哥本哈根大學(xué)的研究人員于2017年10月發(fā)表在“cell report”雜志上的Proteomics Reveals Global Regulation of Protein SUMOylation by ATMand ATR Kinases during Replication Stress文獻(xiàn)， 目的是通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)分析sumo化修飾和磷酸化修飾在細(xì)胞面對(duì)DNA復(fù)制壓力時(shí)的信號(hào)傳遞、相互影響和關(guān)聯(lián)的機(jī)制。

IF 8.282

課題背景

真核生物DNA復(fù)制是耗時(shí)且非常具有挑戰(zhàn)性的過(guò)程，DNA復(fù)制的正常進(jìn)行是維持正常細(xì)胞活動(dòng)的基礎(chǔ)，所以需要精準(zhǔn)的保護(hù)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境的波動(dòng)，一旦保護(hù)機(jī)制失調(diào)導(dǎo)致基因組紊亂，甚至癌癥的發(fā)生。大量報(bào)道顯示，精密準(zhǔn)確的翻譯后修飾通過(guò)DNA損傷應(yīng)答機(jī)制DDR（DNA damage response）為DNA復(fù)制保駕護(hù)航，其中依賴于磷酸化修飾的信號(hào)應(yīng)答轉(zhuǎn)過(guò)程的重要作用多為熟知。最近也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾在該過(guò)程中也同樣起到非常重要的作用。然而整體水平兩種修飾在DNA復(fù)制損傷時(shí)的應(yīng)答反應(yīng)是否有相互影響，相互關(guān)聯(lián)還鮮為人知。本文章的主題帶著這樣的疑問(wèn)對(duì)兩種大規(guī)模組學(xué)相互作用及關(guān)聯(lián)展開(kāi)了深入研究，探討DNA損傷應(yīng)答中兩種組學(xué)的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

分別對(duì)MMC刺激處理的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行SUMO化修飾和磷酸化修飾進(jìn)行蛋白或者肽段富集，進(jìn)行定性定量分析，后通過(guò)分析磷酸化修飾蛋白，SUMO修飾蛋白在表達(dá)量一致性，修飾蛋白種類重疊性，GO功能相似性放面的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在DDR發(fā)生過(guò)程中一些關(guān)鍵蛋白UIMC1，BRCA1等即發(fā)生SUMO化也發(fā)生了磷酸化。并通過(guò)大規(guī)模組學(xué)實(shí)驗(yàn)labelfree實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步對(duì)兩種修飾的蛋白分析，發(fā)現(xiàn)在DNA損傷修復(fù)時(shí)，通過(guò)兩種修飾的響應(yīng)調(diào)控，形成相互作用的網(wǎng)絡(luò)，共同應(yīng)對(duì)外界損傷。 最后，通過(guò)DDR,RS響應(yīng)的關(guān)鍵激酶ATR，ATM給藥前后的的作用底物修飾分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DNA損傷時(shí)ATR激活CHK1，使其發(fā)生磷酸化，且ATR的共同激活因子TOPBP1高度sumo化。進(jìn)一步揭示了兩種修飾作用的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)路線

建立flag-SUMO-2和his10- sumo-2-k0-Q87R穩(wěn)轉(zhuǎn)的U-2-OS細(xì)胞，并進(jìn)行SILAC（穩(wěn)定同位素標(biāo)記）技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)該細(xì)胞使用胸苷阻斷法細(xì)胞周期同步化24h后，給予MMC（絲裂霉素)給藥和不給藥刺激，制造細(xì)胞DNA損傷狀態(tài)， 分別對(duì)陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)染SUMO），SUMO穩(wěn)轉(zhuǎn)給藥刺激和不給藥刺激三種條件處理的細(xì)胞蛋白進(jìn)行IP富集，通過(guò)高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive high-frequency (HF)進(jìn)行質(zhì)譜分析，利用Maxquant軟件對(duì)SUMO化蛋白和SUMO位點(diǎn)進(jìn)行定性定量。其中值得一提的是，在SUMO化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用較經(jīng)典的外源引入FLAG-SUMO2-Q87RSUMO蛋白的突變體方法來(lái)對(duì)SUMO化蛋白進(jìn)行富集，并通過(guò)酶切之后的QQTGG和pyroQQTGG分子量偏移進(jìn)行SUMO位點(diǎn)鑒定。共鑒定出3453個(gè)蛋白，其中702個(gè)顯著變化的SUMO化蛋白。通過(guò)MMC刺激前后的穩(wěn)轉(zhuǎn)SUMO-2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有個(gè)187個(gè)SUMO蛋白是受MMC刺激變化顯著上升的，SUMO位點(diǎn)共311個(gè)。

Sumo化蛋白功能分析

通過(guò)對(duì)187個(gè)MMC處理影響顯著的sumo蛋白進(jìn)行功能注釋和互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要定位于細(xì)胞核中， 且主要與細(xì)胞修復(fù)相關(guān)。

磷酸化修飾分析

在磷酸化大規(guī)模修飾分析實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與SUMO化相同，技術(shù)路線上采用經(jīng)典的磷酸化富集方法-TIO2，并且采用分級(jí)的方式提高磷酸化肽段的鑒定水平。通過(guò)該方法共鑒定到磷酸化位點(diǎn)20900個(gè)，其中650個(gè)磷酸化位點(diǎn)是受MMC處理顯著上調(diào)的。通過(guò)GO分析也發(fā)現(xiàn)主要定位于細(xì)胞何種與DNA損傷修復(fù)相關(guān)，這與sumo的結(jié)果有驚人的相似度。

磷酸化和sumo化聯(lián)合分析

為了說(shuō)明磷酸化和sumo化之間有比較密切的聯(lián)系，比較了這些受MMC影響的蛋白的定量水平的一致性，發(fā)現(xiàn)兩種組學(xué)找到的差異蛋白的定量表達(dá)分布形態(tài)高度一致。

通過(guò)比較蛋白種類的重疊度，發(fā)現(xiàn)有540個(gè)蛋白同時(shí)發(fā)生了類泛素化和磷酸化，其中有17個(gè)蛋白是在MMC刺激之后兩種修飾均上調(diào)的，其中包括已經(jīng)報(bào)道的與DDR相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，比如UIMC1，BRCA1等。

為了挖掘兩種該修飾在DDR 和RS（replication stress）中的作用機(jī)制，進(jìn)一步通過(guò)WB驗(yàn)證了在此過(guò)程中關(guān)鍵的蛋白激酶ATR，ATM的作用底物的磷酸化和SUMO化水平改變。通過(guò)DNA損傷刺激及ATR抑制劑處理前后相關(guān)激酶底物的SUMO化及磷酸化水平，證實(shí)關(guān)鍵激酶的激活是通過(guò)底物的磷酸化和SUMO等進(jìn)行信號(hào)傳遞并形成相互影響。并且進(jìn)行了補(bǔ)充label-free分析，對(duì)以上結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

小編心得

該篇文獻(xiàn)運(yùn)用大量的質(zhì)譜組學(xué)技術(shù)，對(duì)SUMO化，磷酸化在特定條件下進(jìn)行了深入的定性定量研究，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，深入明確的闡述了DNA損傷時(shí)的兩種修飾水平的改變及相互影響，是一篇非常典型的質(zhì)譜應(yīng)用的技術(shù)，其中不僅有修飾富集技術(shù)，還利用了普通labelfree技術(shù)，SILAC技術(shù)等等，這些都是現(xiàn)有質(zhì)譜領(lǐng)域非常經(jīng)典的方法，為大家做組學(xué)甚至是組學(xué)聯(lián)合分析提供了一定的思路，非常值得大家借鑒和學(xué)習(xí)！

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