PTM

隨著質譜技術的不斷進步，大規(guī)模修飾組學的方法也越來越成熟，PTM作為生物體內非常重要的生理現(xiàn)象也逐步被揭示出參與各項生命活動。今天我們就一起來學習一篇運用質譜技術對磷酸化修飾和類泛素化修飾鑒定，找出兩種修飾聯(lián)合作用對在DNA復制損傷壓力時的響應。該篇文獻來自哥本哈根大學的研究人員于2017年10月發(fā)表在“cell report”雜志上的Proteomics Reveals Global Regulation of Protein SUMOylation by ATMand ATR Kinases during Replication Stress文獻， 目的是通過質譜技術分析sumo化修飾和磷酸化修飾在細胞面對DNA復制壓力時的信號傳遞、相互影響和關聯(lián)的機制。

IF 8.282

課題背景

真核生物DNA復制是耗時且非常具有挑戰(zhàn)性的過程，DNA復制的正常進行是維持正常細胞活動的基礎，所以需要精準的保護機制來應對內外環(huán)境的波動，一旦保護機制失調導致基因組紊亂，甚至癌癥的發(fā)生。大量報道顯示，精密準確的翻譯后修飾通過DNA損傷應答機制DDR（DNA damage response）為DNA復制保駕護航，其中依賴于磷酸化修飾的信號應答轉過程的重要作用多為熟知。最近也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾在該過程中也同樣起到非常重要的作用。然而整體水平兩種修飾在DNA復制損傷時的應答反應是否有相互影響，相互關聯(lián)還鮮為人知。本文章的主題帶著這樣的疑問對兩種大規(guī)模組學相互作用及關聯(lián)展開了深入研究，探討DNA損傷應答中兩種組學的關系。

實驗結論

分別對MMC刺激處理的穩(wěn)轉細胞進行SUMO化修飾和磷酸化修飾進行蛋白或者肽段富集，進行定性定量分析，后通過分析磷酸化修飾蛋白，SUMO修飾蛋白在表達量一致性，修飾蛋白種類重疊性，GO功能相似性放面的對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在DDR發(fā)生過程中一些關鍵蛋白UIMC1，BRCA1等即發(fā)生SUMO化也發(fā)生了磷酸化。并通過大規(guī)模組學實驗labelfree實驗進行進一步對兩種修飾的蛋白分析，發(fā)現(xiàn)在DNA損傷修復時，通過兩種修飾的響應調控，形成相互作用的網(wǎng)絡，共同應對外界損傷。 最后，通過DDR,RS響應的關鍵激酶ATR，ATM給藥前后的的作用底物修飾分析驗證，發(fā)現(xiàn)DNA損傷時ATR激活CHK1，使其發(fā)生磷酸化，且ATR的共同激活因子TOPBP1高度sumo化。進一步揭示了兩種修飾作用的機制。

實驗路線

建立flag-SUMO-2和his10- sumo-2-k0-Q87R穩(wěn)轉的U-2-OS細胞，并進行SILAC（穩(wěn)定同位素標記）技術進行細胞培養(yǎng)。對該細胞使用胸苷阻斷法細胞周期同步化24h后，給予MMC（絲裂霉素)給藥和不給藥刺激，制造細胞DNA損傷狀態(tài)， 分別對陰性對照（未轉染SUMO），SUMO穩(wěn)轉給藥刺激和不給藥刺激三種條件處理的細胞蛋白進行IP富集，通過高分辨質譜儀Q-Exactive high-frequency (HF)進行質譜分析，利用Maxquant軟件對SUMO化蛋白和SUMO位點進行定性定量。其中值得一提的是，在SUMO化檢測實驗中，運用較經典的外源引入FLAG-SUMO2-Q87RSUMO蛋白的突變體方法來對SUMO化蛋白進行富集，并通過酶切之后的QQTGG和pyroQQTGG分子量偏移進行SUMO位點鑒定。共鑒定出3453個蛋白，其中702個顯著變化的SUMO化蛋白。通過MMC刺激前后的穩(wěn)轉SUMO-2細胞中，發(fā)現(xiàn)有個187個SUMO蛋白是受MMC刺激變化顯著上升的，SUMO位點共311個。

Sumo化蛋白功能分析

通過對187個MMC處理影響顯著的sumo蛋白進行功能注釋和互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要定位于細胞核中， 且主要與細胞修復相關。

磷酸化修飾分析

在磷酸化大規(guī)模修飾分析實驗中，實驗設計與SUMO化相同，技術路線上采用經典的磷酸化富集方法-TIO2，并且采用分級的方式提高磷酸化肽段的鑒定水平。通過該方法共鑒定到磷酸化位點20900個，其中650個磷酸化位點是受MMC處理顯著上調的。通過GO分析也發(fā)現(xiàn)主要定位于細胞何種與DNA損傷修復相關，這與sumo的結果有驚人的相似度。

磷酸化和sumo化聯(lián)合分析

為了說明磷酸化和sumo化之間有比較密切的聯(lián)系，比較了這些受MMC影響的蛋白的定量水平的一致性，發(fā)現(xiàn)兩種組學找到的差異蛋白的定量表達分布形態(tài)高度一致。

通過比較蛋白種類的重疊度，發(fā)現(xiàn)有540個蛋白同時發(fā)生了類泛素化和磷酸化，其中有17個蛋白是在MMC刺激之后兩種修飾均上調的，其中包括已經報道的與DDR相關的關鍵蛋白，比如UIMC1，BRCA1等。

為了挖掘兩種該修飾在DDR 和RS（replication stress）中的作用機制，進一步通過WB驗證了在此過程中關鍵的蛋白激酶ATR，ATM的作用底物的磷酸化和SUMO化水平改變。通過DNA損傷刺激及ATR抑制劑處理前后相關激酶底物的SUMO化及磷酸化水平，證實關鍵激酶的激活是通過底物的磷酸化和SUMO等進行信號傳遞并形成相互影響。并且進行了補充label-free分析，對以上結論進行驗證。

小編心得

該篇文獻運用大量的質譜組學技術，對SUMO化，磷酸化在特定條件下進行了深入的定性定量研究，并進行關聯(lián)分析，深入明確的闡述了DNA損傷時的兩種修飾水平的改變及相互影響，是一篇非常典型的質譜應用的技術，其中不僅有修飾富集技術，還利用了普通labelfree技術，SILAC技術等等，這些都是現(xiàn)有質譜領域非常經典的方法，為大家做組學甚至是組學聯(lián)合分析提供了一定的思路，非常值得大家借鑒和學習！

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