冰凍切片

低溫恒冷箱冷凍切片制作法

以Shandon As 620 E型恒溫箱冷凍切片機(jī)為例，該機(jī)的箱面上有電子控制板，裝有即時(shí)冷凍鍵和除霜鍵，啟動(dòng)即時(shí)冷凍鍵，機(jī)器馬上進(jìn)行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10分鐘。啟動(dòng)即時(shí)除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15分鐘。有照明鍵一個(gè)，啟動(dòng)該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個(gè)，當(dāng)進(jìn)行一周的工作或者一天的工作后，啟動(dòng)該鍵，可對(duì)工作間進(jìn)行消毒。當(dāng)每天工作完畢時(shí)，可啟動(dòng)密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個(gè)按鍵，兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退鍵，兩個(gè)為微小進(jìn)退鍵，還有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時(shí)的進(jìn)退。

冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺(tái)，溫度可達(dá)-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺(tái)切片機(jī)，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來(lái)。

操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。

④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過(guò)刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30℃。

冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過(guò)和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會(huì)破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí)，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺(tái)上凍起來(lái)，然后依據(jù)不同的編號(hào)，依序切片，這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂。

③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢(shì)來(lái)放置，所謂“砍柴看柴勢(shì)”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭(zhēng)取時(shí)間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水分就存留于組織中，形成了冰晶。

⑤當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái)，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來(lái)軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。

⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片，由于溫度相同，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)象。

冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強(qiáng)熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒(méi)有任何變化的情況下被固定起來(lái)，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鐘。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鐘。

④ 分化。

⑤ 于堿水中返藍(lán)20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦ 脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。

冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內(nèi)完成快速制片過(guò)程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導(dǎo)體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導(dǎo)體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這里不作闡述。

冰凍切片（frozen section）是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。因其制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。冰凍切片的種類(lèi)較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。這些方法，隨著時(shí)代的變遷，科技的發(fā)展，許多年前被認(rèn)為是非常重要的技術(shù)，也逐步被淘汰了。當(dāng)然有些技術(shù)，如低溫恒冷箱冰凍切片法，正在受到重視。

術(shù)中為何做冰凍切片？

病理檢查首先需要將切下的病變組織器官作一系列技術(shù)處理，包括固定、取材、脫水、浸蠟、包埋、切片和染色等，一般需花費(fèi)24小時(shí)方可完成全部制片過(guò)程，然后由病理醫(yī)生用顯微鏡觀察，并做出診斷。這種檢查方法稱(chēng)為常規(guī)石蠟切片，是病理檢查中最常用的方法。但是，這種方法從外科醫(yī)生將病變組織切下，到做出病理診斷，前后通常需要3天的時(shí)間。有時(shí)外科醫(yī)生希望在手術(shù)過(guò)程中馬上了解病變的性質(zhì)，以便及時(shí)確定手術(shù)范圍，并做出相應(yīng)的處理，就要求病理醫(yī)生在手術(shù)過(guò)程中做出病理診斷，此時(shí)就必須快速切片診斷，快速冰凍切片是應(yīng)用的最廣泛的方法。

快速冰凍切片是用于手術(shù)中病理診斷的一種方法，病理醫(yī)生在收到手術(shù)標(biāo)本后約15分鐘之內(nèi)做出診斷，馬上電話告訴手術(shù)醫(yī)生，以便迅速作出下一步治療決策。病理診斷的正確與否直接關(guān)系到手術(shù)臺(tái)上處理患者的下一個(gè)步驟，如乳腺腫塊切除后的冰凍報(bào)告是良性的纖維腺瘤，則可宣告手術(shù)結(jié)束；如冰凍報(bào)告是乳腺癌，就需要進(jìn)一步擴(kuò)大手術(shù)范圍，切除整個(gè)乳房及腋窩淋巴結(jié)；肢體的惡性腫瘤如骨肉瘤，通常需截肢。冰凍切片病理診斷對(duì)手術(shù)治療有重大幫助和指導(dǎo)意義，診斷要力求正確、迅速和可靠。

然而，快速冰凍切片要在如此之短的時(shí)間內(nèi)做出診斷，難度相當(dāng)高，取材有局限性，制作切片的質(zhì)量也不如常規(guī)石蠟切片高。因此，冰凍切片的確診率比常規(guī)切片低，有一定的延遲診斷率和誤診率，所以冰凍切片診斷尚不能廣泛應(yīng)用，即使選擇性應(yīng)用，事后仍需用常規(guī)石蠟切片對(duì)照和存檔。

快速冰凍切片主要用于下列幾種情況：

①確定病變是否為腫瘤；

②判斷腫瘤的良惡性；

③了解腫瘤有無(wú)播散到鄰近淋巴結(jié)或臟器；

④確定手術(shù)切緣有無(wú)腫瘤浸潤(rùn)，以了解手術(shù)范圍是否足夠大；

⑤幫助識(shí)別手術(shù)中某些意外和確定可疑微小組織（如甲狀旁腺、輸卵管或輸精管等）；

⑥取新鮮組織供激素受體測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)、電鏡檢查和分子生物學(xué)檢查等特殊需要。

冰凍干燥

原理

為冰凍組織保持高度真空，直到去除組織中的水分。

過(guò)程

小塊組織驟冷→立即在真空干燥脫水（－30～－40℃）冰升華，水氣去除，不會(huì)發(fā)生酶的彌散→材料干后，升到室溫浸于石蠟或碳蠟包埋。

特點(diǎn)

能出色地保存組織的酶活性，還有助于保持組織的結(jié)構(gòu)。但儀器貴，需時(shí)長(zhǎng)。

冰凍替代法

原理

低溫下用液體脫水劑取代組織中的水分。

過(guò)程

組織塊驟冷→組織內(nèi)的水，在低溫（－40℃～－70℃）液體脫水劑中被替代（醇、丙酮），同時(shí)起到固定作用→脫水組織漸恢復(fù)到室溫，用石蠟包埋。

特點(diǎn)

① 新鮮組織在24小時(shí)內(nèi)制成切片。

② 可保存較多的酶活性。

③ 經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單且有重復(fù)性，但對(duì)細(xì)胞器保存不佳，不能用于電鏡。

防止脫片的方法

冰凍切片是較難掌握的病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，要做好一張冰凍切片絕不能只求速度，否則常適得其反[2，3]。為了不漏診、誤診，及時(shí)準(zhǔn)確地作出診斷，確保結(jié)果科學(xué)性、正確性、真實(shí)性，這就需要醫(yī)護(hù)人員在進(jìn)行冰凍切片時(shí)應(yīng)有嚴(yán)格的責(zé)任心、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、密切聯(lián)系臨床、豐富的工作實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，不斷提高切片質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，這樣才能更好地為臨床和科研服務(wù)。隨著科學(xué)技術(shù)的現(xiàn)代化實(shí)現(xiàn)，病理學(xué)科也引進(jìn)了許多自動(dòng)化裝置，如病理標(biāo)本的自動(dòng)脫水機(jī)，自動(dòng)包埋機(jī)、自動(dòng)切片機(jī)、自動(dòng)染色機(jī)、自動(dòng)免疫組化機(jī)等。并隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)展了遠(yuǎn)程病理圖文會(huì)診，為臨床提供了更便捷、可靠、有效的診斷治療建議。

新鮮組織的制備

組織盡可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：① CO2氣（－78℃） ② 丙酮干冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷卻的丙烷（－19℃）。液氮適用于組織化學(xué)，較安全。缺點(diǎn)：組織塊易發(fā)生龜裂。

固定組織的制備

為防止水解酶和其他物質(zhì)的移位、彌散，常用4℃、24小時(shí)的甲醛固定能很好地保存酶類(lèi)。但對(duì)許多脫氫酶和轉(zhuǎn)移酶能滅活。故不宜使用，低溫，冷甲醛短時(shí)間固定（10分鐘左右）固定，可顯示琥珀酸脫氫酶。

電鏡出現(xiàn)后，需要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，以4%緩沖戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定較好。這些固定液主要用于水解酶，而不適于許多氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。

恒冷箱的溫度

一般在冷凍后10分鐘，到接近冷室溫度時(shí)再切，一般組織在－15～－20℃切片最易成功。每種組織有其合適的切片溫度、刀的溫度和冷室溫度，Pearse及Bancroft的經(jīng)驗(yàn)如下：

組織 刀溫度 組織溫度 恒冷箱溫度

肝 -18 -10 -5

腎 -15 -8 -5

皮膚 -35 -10 -5

腦 -18 -5 -5

固定組織一般高3-5度

切片機(jī)的使用

抗卷板的前緣與刀面須有足夠的距離，使切片平滑通過(guò)?？咕戆迓愿哂诘睹娴淖罡唿c(diǎn)?？蓱{經(jīng)驗(yàn)調(diào)整刀對(duì)組織的角度，一般新刀為20゜。操作程序：先接通電源，調(diào)定恒冷箱溫度，調(diào)整切片刀的角度，調(diào)定切片厚度，標(biāo)本置載臺(tái)致冷達(dá)所需溫度后，將其安放在切片機(jī)推進(jìn)器上。即可切片。恒冷箱視使用情況每周或每月清潔一次冰霜。新刀切片滿意，舊刀用自動(dòng)磨刀機(jī)磨刀較好。如果切片刀與抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把銳利的刀，就能獲得理想的切片。

（1）在手術(shù)進(jìn)行中，突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷，原定手術(shù)方案不相符合，或者懷疑時(shí)，需要病理確定。

（2）了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定是否需要徹底掃除淋巴結(jié)或者其它的治療措施。

（3）對(duì)于已確定為惡性腫瘤的患者，則需要了解其手術(shù)范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。

（4）在做剖腹探查時(shí)所發(fā)現(xiàn)的腫塊或者異樣的組織。

（5）顯示組織中的脂肪和脂類(lèi)物質(zhì)，這常見(jiàn)于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。

（6）某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等。

（7）神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。

（8）對(duì)某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。

冰凍切片優(yōu)點(diǎn)

1．簡(jiǎn)便，可以不需要對(duì)組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。

2．快速，用時(shí)短。

3．組織變化不大。

4．能很好保存脂肪，類(lèi)脂等成分。

5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類(lèi)，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。

冰凍切片缺點(diǎn)

1．不容易做連續(xù)切片。

2．切取的組織不能過(guò)大，組織過(guò)大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。

3．不容易制作較薄的切片。

4．組織塊在凍結(jié)過(guò)程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。

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