固定化酶技術(shù)酶的定向固定化技術(shù)

1、共價(jià)固定法

選擇性地利用酶分子表面遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的特定稀有基團(tuán)(如巰基) 進(jìn)行反應(yīng)，使該基團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)來(lái)固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達(dá)到控制其空間取向的目的。

2、氨基酸置換法

利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個(gè)氨基酸分子，通過(guò)該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團(tuán)控制固定方向。

3、抗體耦聯(lián)法

大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團(tuán)?？梢酝ㄟ^(guò)賴氨酸的- 氨基或末端氨基、天冬氨酸的- 氨基、谷氨酸的- 氨基或末端羧基進(jìn)行一般性的偶聯(lián)。

4、生物素--親和素親合法

生物素是存在于所有活細(xì)胞內(nèi)但含量甚微( <0. 0001 %) 的中性小分子輔酶。親和素是一個(gè)含有四個(gè)相同亞基的四聚體，每個(gè)亞基均含一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。

5、疏水定向固定法

細(xì)胞粘著分子和其他細(xì)胞表面分子通常通過(guò)疏水作用固定在脂質(zhì)膜上，磷脂錨定是常選擇的方式。接觸位點(diǎn)A糖蛋白可通過(guò)神經(jīng)酰胺疏水固定在細(xì)胞表面。

1、交聯(lián)溶解酶

交聯(lián)溶解酶(Cross-LinkedQissolued Enzyme，CLEs)是通過(guò)交聯(lián)劑對(duì)酶分子直接交聯(lián)而獲得，也是操作最簡(jiǎn)單的一種方法。

2、交聯(lián)酶晶體

交聯(lián)酶晶體(Cross-Linked Enzyme Crystals，CLECs)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型酶晶體催化劑，是酶結(jié)晶技術(shù)和化學(xué)交聯(lián)技術(shù)的結(jié)合。

3、交聯(lián)酶聚合體

交聯(lián)酶聚合體(Cross-Linked Enzyme Aggregate，CLEAs)酶分子經(jīng)沉淀形成不溶性酶聚集體再經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)形成。

邱廣亮 等用磁性聚乙二醇膠體粒子作載體，采用吸附--交聯(lián)法，制備出具有磁響應(yīng)性的固定化糖化酶，簡(jiǎn)稱磁性酶(MIE) 一方面由于載體具有兩親性，MIE 可穩(wěn)定的分散于水相或有機(jī)相中，充分的進(jìn)行酶催化反應(yīng);另一方面，由于載體具有磁響應(yīng)性，MIE 又可借助外部磁場(chǎng)簡(jiǎn)單地回收，反復(fù)使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo 等將鈦合金表面用丙烯酸胺等離子體處理引入氨基，然后將含碳硝化甘油接枝于鈦合金表面，或者將等離子體處理的鈦合金先由琥珀酸酐處理，再用含碳硝化甘油接枝，進(jìn)而將溶菌酶和骨形態(tài)蛋白進(jìn)行固定，實(shí)現(xiàn)了生物分子在生物惰性金屬上的固定化。

1、吸附法

吸附法是最簡(jiǎn)單的同定化方法.包括物理吸附和離子交換吸附。物理吸附法常用的吸附劑有活性炭、硅藻土、多空玻璃等。離子吸附法是酶與載體通過(guò)范德華力、離子鍵和氫鍵等作用力固定。

2、包埋法

包埋法的基本原理是載體與酶溶液混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過(guò)物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中，從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法。

3.載體偶聯(lián)法

載體偶聯(lián)法是指酶分子的非必須基團(tuán)與載體表面的活性功能基團(tuán)通過(guò)形成化學(xué)共價(jià)健實(shí)現(xiàn)不可逆結(jié)合的酶固定方法，又稱共價(jià)結(jié)合法。

4、交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用雙功能或多功能交聯(lián)試劑，在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價(jià)鍵的一種酶固定方法。已報(bào)道的利用幾丁聚糖、殼聚糖等為載體，在戊二醛、乙二醛等多功能試劑交聯(lián)-半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多種酶。

固定比酶拉術(shù)是把從生物體內(nèi)提取出來(lái)的酶，用人工方法同定在載體上。

1916年N elson和GrImn最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象?？茖W(xué)家們就開(kāi)始了同定化酶的研究工作。1969年日本一家制藥公司第一次將同定化的酰化氨基酸水解酶用于從混合氨基酸中生產(chǎn)L一氮基酸，開(kāi)辟了固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的新紀(jì)元。我國(guó)的固定化酶研究開(kāi)始于1970年，首先是微生物所和I上海生化所的工作者開(kāi)始了固定化酶的研究 。

固定化酶技術(shù)在醫(yī)藥上的應(yīng)用進(jìn)展

利用固定化酶制備單一對(duì)映體藥物

溶膠凝膠固定化酶測(cè)定人體血清中的膽固醇

固定化葡萄糖氧化酶進(jìn)行臨床血糖檢測(cè)

葡聚糖磁性毫微粒固定化L-天冬酰胺酶治療急性淋巴白血病

固定化黃色短桿菌、大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸

固定化基因工程菌CTB2 生產(chǎn)L-苯丙氨酸等。

固定化酶技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用進(jìn)展

酶反應(yīng)器是同固定化酶制成的，它可以直接或與其他檢測(cè)器組成酶電極、酶?jìng)鞲衅鞯确治鰴z測(cè)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè);

把脫色酶與苯胺降解菌混合固定用來(lái)處理染料廢水;

造紙廠紙漿漂白中用上木聚糖酶和漆酶可以避免生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生不容易以生物方法分解的大量氯代有機(jī)物質(zhì)，從而進(jìn)一步減少這一生產(chǎn)過(guò)程中的污染問(wèn)題。

固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

尹桂山 等采用固定化胰酶水解牛乳中的酪蛋白，降低了牛乳中酪蛋白的含量，從而降低了牛乳中酪蛋白與清蛋白的比例，使牛乳更易消化吸收;

采用聚乙烯醇固定化菊粉酶，用其水解菊芋，作為發(fā)酵原料生產(chǎn)乙醇，在 28℃，p H 5.2，發(fā)酵液糖度為 20%的條件下，保持反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵液的流動(dòng)速度為 42 m L/min，得到最大的發(fā)酵速率和酒精轉(zhuǎn)化率 ;

用磁性固定化酶水解甘薯淀粉制備微孔淀粉，探討不同處理工藝，如固定化酶用量、反應(yīng)時(shí)間、溫度、p H 等對(duì)微孔淀粉品質(zhì)的影響，確定了最佳工藝。

目前，固定化酶技術(shù)已成為酶工程研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。研究探索新的酶固定化技術(shù)、提高固定化酶活性收率、延長(zhǎng)半衰期、降低成本將成為固定化酶研究領(lǐng)域的主要研究?jī)?nèi)容。隨著固定化酶研究的深入，必將在微生物發(fā)酵、酶工程、精細(xì)化工、環(huán)境保護(hù)、制藥、生物傳感器等領(lǐng)域，尤其是在大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化、手性化合物的合成以及其他傳統(tǒng)酶和蛋白質(zhì)等方面得到更廣泛的應(yīng)用。