固定化酶技術(shù)新型載體酶固定化方法

邱廣亮 等用磁性聚乙二醇膠體粒子作載體，采用吸附--交聯(lián)法，制備出具有磁響應(yīng)性的固定化糖化酶，簡稱磁性酶(MIE) 一方面由于載體具有兩親性，MIE 可穩(wěn)定的分散于水相或有機(jī)相中，充分的進(jìn)行酶催化反應(yīng);另一方面，由于載體具有磁響應(yīng)性，MIE 又可借助外部磁場簡單地回收，反復(fù)使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo 等將鈦合金表面用丙烯酸胺等離子體處理引入氨基，然后將含碳硝化甘油接枝于鈦合金表面，或者將等離子體處理的鈦合金先由琥珀酸酐處理，再用含碳硝化甘油接枝，進(jìn)而將溶菌酶和骨形態(tài)蛋白進(jìn)行固定，實(shí)現(xiàn)了生物分子在生物惰性金屬上的固定化。

1、吸附法

吸附法是最簡單的同定化方法.包括物理吸附和離子交換吸附。物理吸附法常用的吸附劑有活性炭、硅藻土、多空玻璃等。離子吸附法是酶與載體通過范德華力、離子鍵和氫鍵等作用力固定。

2、包埋法

包埋法的基本原理是載體與酶溶液混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中，從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法。

3.載體偶聯(lián)法

載體偶聯(lián)法是指酶分子的非必須基團(tuán)與載體表面的活性功能基團(tuán)通過形成化學(xué)共價健實(shí)現(xiàn)不可逆結(jié)合的酶固定方法，又稱共價結(jié)合法。

4、交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用雙功能或多功能交聯(lián)試劑，在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價鍵的一種酶固定方法。已報道的利用幾丁聚糖、殼聚糖等為載體，在戊二醛、乙二醛等多功能試劑交聯(lián)-半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多種酶。

固定比酶拉術(shù)是把從生物體內(nèi)提取出來的酶，用人工方法同定在載體上。

1916年N elson和GrImn最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象?？茖W(xué)家們就開始了同定化酶的研究工作。1969年日本一家制藥公司第一次將同定化的?；被崴饷赣糜趶幕旌习被嶂猩a(chǎn)L一氮基酸，開辟了固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的新紀(jì)元。我國的固定化酶研究開始于1970年，首先是微生物所和I上海生化所的工作者開始了固定化酶的研究 。

1、交聯(lián)溶解酶

交聯(lián)溶解酶(Cross-LinkedQissolued Enzyme，CLEs)是通過交聯(lián)劑對酶分子直接交聯(lián)而獲得，也是操作最簡單的一種方法。

2、交聯(lián)酶晶體

交聯(lián)酶晶體(Cross-Linked Enzyme Crystals，CLECs)是近年來發(fā)展起來的新型酶晶體催化劑，是酶結(jié)晶技術(shù)和化學(xué)交聯(lián)技術(shù)的結(jié)合。

3、交聯(lián)酶聚合體

交聯(lián)酶聚合體(Cross-Linked Enzyme Aggregate，CLEAs)酶分子經(jīng)沉淀形成不溶性酶聚集體再經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)形成。

1、共價固定法

選擇性地利用酶分子表面遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的特定稀有基團(tuán)(如巰基) 進(jìn)行反應(yīng)，使該基團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價交聯(lián)來固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達(dá)到控制其空間取向的目的。

2、氨基酸置換法

利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個氨基酸分子，通過該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團(tuán)控制固定方向。

3、抗體耦聯(lián)法

大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團(tuán)?？梢酝ㄟ^賴氨酸的- 氨基或末端氨基、天冬氨酸的- 氨基、谷氨酸的- 氨基或末端羧基進(jìn)行一般性的偶聯(lián)。

4、生物素--親和素親合法

生物素是存在于所有活細(xì)胞內(nèi)但含量甚微( <0. 0001 %) 的中性小分子輔酶。親和素是一個含有四個相同亞基的四聚體，每個亞基均含一個生物素結(jié)合位點(diǎn)。

5、疏水定向固定法

細(xì)胞粘著分子和其他細(xì)胞表面分子通常通過疏水作用固定在脂質(zhì)膜上，磷脂錨定是常選擇的方式。接觸位點(diǎn)A糖蛋白可通過神經(jīng)酰胺疏水固定在細(xì)胞表面。

固定化酶技術(shù)在醫(yī)藥上的應(yīng)用進(jìn)展

利用固定化酶制備單一對映體藥物

溶膠凝膠固定化酶測定人體血清中的膽固醇

固定化葡萄糖氧化酶進(jìn)行臨床血糖檢測

葡聚糖磁性毫微粒固定化L-天冬酰胺酶治療急性淋巴白血病

固定化黃色短桿菌、大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸

固定化基因工程菌CTB2 生產(chǎn)L-苯丙氨酸等。

固定化酶技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用進(jìn)展

酶反應(yīng)器是同固定化酶制成的，它可以直接或與其他檢測器組成酶電極、酶傳感器等分析檢測系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)對環(huán)境污染物的監(jiān)測;

把脫色酶與苯胺降解菌混合固定用來處理染料廢水;

造紙廠紙漿漂白中用上木聚糖酶和漆酶可以避免生產(chǎn)過程中產(chǎn)生不容易以生物方法分解的大量氯代有機(jī)物質(zhì)，從而進(jìn)一步減少這一生產(chǎn)過程中的污染問題。

固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

尹桂山 等采用固定化胰酶水解牛乳中的酪蛋白，降低了牛乳中酪蛋白的含量，從而降低了牛乳中酪蛋白與清蛋白的比例，使牛乳更易消化吸收;

采用聚乙烯醇固定化菊粉酶，用其水解菊芋，作為發(fā)酵原料生產(chǎn)乙醇，在 28℃，p H 5.2，發(fā)酵液糖度為 20%的條件下，保持反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵液的流動速度為 42 m L/min，得到最大的發(fā)酵速率和酒精轉(zhuǎn)化率 ;

用磁性固定化酶水解甘薯淀粉制備微孔淀粉，探討不同處理工藝，如固定化酶用量、反應(yīng)時間、溫度、p H 等對微孔淀粉品質(zhì)的影響，確定了最佳工藝。

目前，固定化酶技術(shù)已成為酶工程研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。研究探索新的酶固定化技術(shù)、提高固定化酶活性收率、延長半衰期、降低成本將成為固定化酶研究領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容。隨著固定化酶研究的深入，必將在微生物發(fā)酵、酶工程、精細(xì)化工、環(huán)境保護(hù)、制藥、生物傳感器等領(lǐng)域，尤其是在大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化、手性化合物的合成以及其他傳統(tǒng)酶和蛋白質(zhì)等方面得到更廣泛的應(yīng)用。