共聚焦顯微技術(shù)?優(yōu)點

成像清晰

由于利用光學或數(shù)字技術(shù)消除了聚焦平面以外的熒光信號的干擾, 使我們要分析的區(qū)域內(nèi)的圖像清晰度提高, 得到更為準確的定位和定量信息。

連續(xù)片層掃描及圖像重組

共聚焦顯微鏡在計算機的控制下可以對樣品中的不同層面進行連續(xù)逐層掃描, 以獲得各個層面的圖像, 層面之間的間距可以達到0. 1微米甚至更小, 在圖像獲得后由計算機自動將這些圖形重組為三維圖像。與普通光學照相機獲得的圖像比較,共聚焦所得到的重組三維立體圖形清晰度高、層次分明、立體感更強, 通過計算機軟件處理, 可以對三維圖形進行任何形式的旋轉(zhuǎn), 可以從任何角度進行觀察, 還可以對細胞內(nèi)的某個選定結(jié)構(gòu)進行長度、體積的測量和計算, 在分析細胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)和某些物質(zhì)在細胞內(nèi)的精確定位方面具有明顯的優(yōu)勢, 這也是共聚焦顯微技術(shù)諸多功能中應用最廣泛的一種。

多標記技術(shù)

利用共聚焦系統(tǒng)可以同時對利用兩種或三種不同的熒光染料分別標記了細胞的不同結(jié)構(gòu)(如分別標記染色體和細胞骨架系 統(tǒng)) 的樣品進行觀察, 這樣一次實驗觀察就可以獲得細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的信息, 對不同結(jié)構(gòu)組分的定位、相互聯(lián)系方式進行研究。在最終獲得的圖像可以分開表示單個結(jié)構(gòu); 也可以將圖片迭加在一起, 用不同顏色表示不同的結(jié)構(gòu), 更加直觀, 這是普通熒光顯微鏡無法做到的。

活體觀察

除了可以對固定標本的細胞進行觀察外, 共聚焦顯微技術(shù)還可以在不對細胞進行固定或其他損傷性處理的情況下進行觀察, 獲得活細胞內(nèi)[5]的信息, 顯示在活體情況下細胞內(nèi)的真實結(jié)構(gòu)和生理學特征。更為重要的是利用共聚焦顯微鏡可以跟蹤自然狀態(tài)下或受某種因素刺激后活細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生理過程隨時間變化的情況, 得到準確而直觀的動態(tài)變化資料, 為分析細胞內(nèi)的生理生化反應提供直接的實驗數(shù)據(jù)。

獲得數(shù)量化信息

共聚焦顯微技術(shù)不僅能夠?qū)毎麅?nèi)熒光進行定位, 還可以對其進行定量分析, 獲得二維或三維空間內(nèi)分布在樣品不同部位的熒光強度數(shù)值以及熒光強度在各種處理條件下的變化情況。量化信息的獲得是研究活細胞內(nèi)生理生化反應時重要的手 段, 而共聚焦顯微技術(shù)在這一方面的優(yōu)勢是其他技術(shù)所無法達到的。

目前共聚焦的實現(xiàn)有兩種方式：激光共聚焦和數(shù)字共聚焦。

這種共聚焦技術(shù)利用激光[3]作為激發(fā)光源，將激光聚焦于樣品中的某一點，這樣只有該點附近的區(qū)域有熒光，其他沒有被激發(fā)的部位沒有熒光，這一區(qū)域發(fā)出的熒光反射到光電倍增管，在光電倍增管前設有1 個計算機控制的可調(diào)節(jié)針孔， 保證只有被激發(fā)點發(fā)出的熒光才能到達光電管，而附近其他點所發(fā)出的熒光被擋在視野之外。采用計算機控制激光和針孔， 對細胞內(nèi)的某一層面進行掃描，可以獲得清晰的二維圖像。

這一技術(shù)成像速度快、自動化程度高。但激光具有單色性，一種激光器只能發(fā)出某幾個特定波長的激光，而熒光染料的種類很多，其激發(fā)光波長各不相同，這樣在使用某種型號的激光器時，只有少數(shù)幾種熒光染料可以使用， 而其他大多數(shù)的染料不能使用；目前同時配備數(shù)個不同激光器或多光子脈沖激光器的激光共聚焦系統(tǒng)的出現(xiàn)，雖然可以解決這一難題，但是設備結(jié)構(gòu)復雜、價格昂貴，維護保養(yǎng)要求較高。