共聚焦顯微技術(shù)原理

成像清晰

由于利用光學(xué)或數(shù)字技術(shù)消除了聚焦平面以外的熒光信號的干擾, 使我們要分析的區(qū)域內(nèi)的圖像清晰度提高, 得到更為準(zhǔn)確的定位和定量信息。

連續(xù)片層掃描及圖像重組

共聚焦顯微鏡在計算機(jī)的控制下可以對樣品中的不同層面進(jìn)行連續(xù)逐層掃描, 以獲得各個層面的圖像, 層面之間的間距可以達(dá)到0. 1微米甚至更小, 在圖像獲得后由計算機(jī)自動將這些圖形重組為三維圖像。與普通光學(xué)照相機(jī)獲得的圖像比較,共聚焦所得到的重組三維立體圖形清晰度高、層次分明、立體感更強(qiáng), 通過計算機(jī)軟件處理, 可以對三維圖形進(jìn)行任何形式的旋轉(zhuǎn), 可以從任何角度進(jìn)行觀察, 還可以對細(xì)胞內(nèi)的某個選定結(jié)構(gòu)進(jìn)行長度、體積的測量和計算, 在分析細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)和某些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的精確定位方面具有明顯的優(yōu)勢, 這也是共聚焦顯微技術(shù)諸多功能中應(yīng)用最廣泛的一種。

多標(biāo)記技術(shù)

利用共聚焦系統(tǒng)可以同時對利用兩種或三種不同的熒光染料分別標(biāo)記了細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)(如分別標(biāo)記染色體和細(xì)胞骨架系 統(tǒng)) 的樣品進(jìn)行觀察, 這樣一次實驗觀察就可以獲得細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的信息, 對不同結(jié)構(gòu)組分的定位、相互聯(lián)系方式進(jìn)行研究。在最終獲得的圖像可以分開表示單個結(jié)構(gòu); 也可以將圖片迭加在一起, 用不同顏色表示不同的結(jié)構(gòu), 更加直觀, 這是普通熒光顯微鏡無法做到的。

活體觀察

除了可以對固定標(biāo)本的細(xì)胞進(jìn)行觀察外, 共聚焦顯微技術(shù)還可以在不對細(xì)胞進(jìn)行固定或其他損傷性處理的情況下進(jìn)行觀察, 獲得活細(xì)胞內(nèi)[5]的信息, 顯示在活體情況下細(xì)胞內(nèi)的真實結(jié)構(gòu)和生理學(xué)特征。更為重要的是利用共聚焦顯微鏡可以跟蹤自然狀態(tài)下或受某種因素刺激后活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生理過程隨時間變化的情況, 得到準(zhǔn)確而直觀的動態(tài)變化資料, 為分析細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)提供直接的實驗數(shù)據(jù)。

獲得數(shù)量化信息

共聚焦顯微技術(shù)不僅能夠?qū)?xì)胞內(nèi)熒光進(jìn)行定位, 還可以對其進(jìn)行定量分析, 獲得二維或三維空間內(nèi)分布在樣品不同部位的熒光強(qiáng)度數(shù)值以及熒光強(qiáng)度在各種處理條件下的變化情況。量化信息的獲得是研究活細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)時重要的手 段, 而共聚焦顯微技術(shù)在這一方面的優(yōu)勢是其他技術(shù)所無法達(dá)到的。

共聚焦顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍包括形態(tài)學(xué)觀察與測量、生物學(xué)測量蛋白質(zhì)功能檢測與包括在光譜測量中的其它方面的應(yīng)用。

其中該技術(shù)在形態(tài)學(xué)的觀察與測量方面包括亞細(xì)胞器定位，如最簡單的二維定位、定量及三維定位、圖像重組等。

生物學(xué)測量方面可以分為動態(tài)與靜態(tài)的生物學(xué)測量，在動態(tài)與靜態(tài)水平都可以同時檢測活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化(Mg2+ 、Na+ 、K+等)、自由基的動靜態(tài)水平、線粒體膜電位的動靜態(tài)變化及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位（不過靜態(tài)測量時需用固定樣品）。此外，動態(tài)測量還可以對藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程進(jìn)行定位分布及定量。

蛋白質(zhì)功能檢測[6]可分為蛋白熒光恢復(fù)的測量(FRAP)與FLIP、籠索解籠索的測量與動態(tài)/靜態(tài)兼可的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)三種測量方式。