克倫特羅化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測方法

試劑盒組成

1、微量測試孔:每條8孔，每板12條

2、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液:

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶

3、96孔化學(xué)發(fā)光板×1塊 (包被有偶聯(lián)抗原)

4、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶)1ppm

5、酶標(biāo)記抗體

6、顯色劑

7、終止液

8、20×濃縮洗滌液

9、2×濃縮復(fù)溶液

(1)微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

(2)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置

(3)均質(zhì)器

(4)振蕩器

(5)渦旋儀

(6)離心機

在化學(xué)發(fā)光板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的氯霉素與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素藥物的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，再加入底物用光子計數(shù)儀測定各孔的光子計數(shù)，光子計數(shù)的強度隨氯霉素濃度的升高而逐漸下降，成良好的負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中氯霉素類藥物的殘留量。

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。

【中文名稱】:克侖特羅

【簡寫拼音】:KLTL

【英文名稱】:Clenbuterol

【所屬類別】:平喘藥\β腎上腺素受體激動劑

b-克侖特羅(clenbuterol，CLE)是一種腎上腺受體激動劑即神經(jīng)興奮劑。此類藥品在臨床上用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進動物生長，被一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖促進劑非法使用。其殘留量可導(dǎo)致人體肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，對消費者的健康極有危害?，F(xiàn)已被明令禁止用于養(yǎng)殖業(yè)。HPLC或GC-MS一直用作檢測β興奮劑的方法，但是其前處理步驟費用昂貴。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒則可經(jīng)濟、快速地檢測尿，肌肉，肝臟及飼料中的CLE。

…反應(yīng)停止液為1M硫酸，避免接觸皮膚

…不要使用過了有效日期的克倫特羅測定試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低

…不要交換使用不同批號的盒中試劑

使用說明

A、注意事項

1、使用前先將克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標(biāo)記物，底物溶液及微量測試孔條置于室溫下，回溫30分鐘。

2、洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋 3、回溫后，取出所需微量測試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4o℃保存。

尿液:離心

組織:用柱層析法預(yù)純化。

飼料:酸化，中和離心。

樣品處理需要的時間:(10個樣品)

飼料……………………………60分鐘

尿液……………………………10分鐘

組織……………………………6小時

測試時間: 約1小時

8.1尿樣以2500轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清部分(清亮部分)用于檢測。若尿樣呈渾濁狀，需先用濾紙過濾，否則會影響測定數(shù)值。本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算(采用曲線定量), 與德國Bio-pharm公司一致。反應(yīng)體系加液量為20μl樣品: 100μl酶液。(見第4頁尿樣快速檢測程序)。

8.2.1帶有低脂肪的肝，肉，或組織

…5g粉碎的樣品與25ml 50mM HCL 混合，振蕩1.5小時，勻漿。

…稱6g勻漿物(相當(dāng)于1g肝臟)，加入離心管中。

…10-15℃以4000轉(zhuǎn)/分或更高速，離心15分鐘

…轉(zhuǎn)移上清液到另一個離心管中，加300μl 1MNaOH 混合15分鐘。

…加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩沖液(pH3.0)，簡單的混合后放置4℃至少1.5小時或過夜。

…10-15℃以4000轉(zhuǎn)/分或更高速，離心15分鐘。分離全部上清液(應(yīng)該是清亮的)，使其升至室溫(20-25℃)，然后用C18柱純化(見C18柱純化步驟)。

8.2.2 肉和組織

…5g 粉碎的樣品與25ml50mM Tris 緩沖液pH8.5混合，振蕩0.5小時，勻漿。

…加入15ml庚烷(n-heptane)振蕩5分鐘除去脂肪。

…4000g或更高的速度10-15℃離心5分鐘

…用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層

…再用15ml庚烷(n-heptane)重復(fù)步驟2-4

…向勻漿的肉液中加入0.5ml半濃的鹽酸，振蕩1小時

…稱6g均質(zhì)物(相當(dāng)于1g肝臟)，加入離心管中。

…以下從8.2.1的第一個離心步驟開始，像處理肝臟一樣繼續(xù)進行處理。

C18柱以下列方式純化

所有試劑和樣品處理必須在室溫條件下(20-25℃)并嚴(yán)格控制過柱時的流速。

…用3ml甲醇(100%)洗滌柱子，流速為1滴/每秒

…用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)

…樣品進柱(肝，肉，或組織的全部上清液)

…用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)

…用正壓去除殘留的流體并且用空氣或氮氣吹2分鐘干燥柱子

…用2ml甲醇(100%)洗脫樣品，流速為15滴/分鐘

…在50-60℃并且在弱空氣或氮氣流下完全蒸發(fā)溶劑

…用1ml蒸流水溶解干燥的殘留物，取50μl進行分析

注意:

樣品的保存

…未處理的樣品冷凍保存

…HCL勻漿后的樣品在2-8℃穩(wěn)定3天

…以磷酸二氫鉀緩沖液提取后的樣品(C18柱純化之前)在2-8℃穩(wěn)定2天，使用前需離心。

…C18柱純化步驟6所獲得的甲醇洗脫物可以冷凍保存數(shù)周，在2-8℃穩(wěn)定2周。

…用蒸餾水溶解的干燥殘留物(步驟8)在2-8℃穩(wěn)定1周。

C、操作步驟

本產(chǎn)品的酶標(biāo)記物與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液均直接使用，無需再稀釋。

1、于適當(dāng)微孔中分別加入100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。

3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標(biāo)記物。

4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1小時。

5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

8、于室溫下避光靜置溫育20分鐘。

9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。

10、用化學(xué)發(fā)光儀于下判讀。

D、判定

1. 計算B/B0值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線。

3. 根據(jù)每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。

4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

H、再現(xiàn)性

針對克倫特羅檢測試劑盒精密度測試，重復(fù)6次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(%CV).

克倫特羅測定試劑盒的平均檢測下限約為0.05ng/g(0.05ppb)。

與克倫特羅類似物的交叉反應(yīng):

克倫特羅(Clenbuterol) 100%

特布他林Terbutalin 4%

沙丁胺醇Salbutamol 11%

異丙腎上腺素Isoproterenol <2%

腎上腺素Adrenalin <2%

去甲腎上腺素Noradrenalin <2%

回收率為90%±15%

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之，0標(biāo)準(zhǔn)液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質(zhì)。

…反應(yīng)停止液為1M硫酸，避免接觸皮膚

…不要使用過了有效日期的克倫特羅測定試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低

…不要交換使用不同批號的盒中試劑

1、微量測試孔:每條8孔，每板12條

2、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶

3、96孔化學(xué)發(fā)光板×1塊 (包被有偶聯(lián)抗原)

4、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(1ml/瓶)

0ppb，1ppb，3ppb，9ppb，27ppb，81ppb

5、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶)1ppm

6、酶標(biāo)記抗體

7、顯色劑

8、20×濃縮洗滌液

9、2×濃縮復(fù)溶液

A、注意事項

1、使用前先將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標(biāo)記物，底物溶液及微量測試孔條置于室溫下，回溫30分鐘。

2、洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋 3、回溫后，取出所需微量測試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4o℃保存。

1.待測物為組織樣本，則依以下方法進行處理

a.取3g樣本、4ml蒸餾水與6ml 乙酸乙酯置入離心管中，震蕩約5分鐘，使其充分混合均勻。

b.離心10分鐘(3000rpm)，取4ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50℃下氮氣吹干(溫度請勿超過50oC)。

c.加入1ml萃取稀釋液，震蕩約10秒鐘后備用。

C、操作步驟

本產(chǎn)品的酶標(biāo)記物與氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液均直接使用，無需再稀釋。

1、于適當(dāng)微孔中分別加入100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。

3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標(biāo)記物。

4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1小時。

5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

8、于室溫下避光靜置溫育20分鐘。

9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。

10、用化學(xué)發(fā)光儀于下判讀。

D、判定

1. 計算B/B0值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線。

3. 根據(jù)每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。

4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

E、標(biāo)準(zhǔn)曲線

F、靈敏度

氯霉素試劑檢測盒的平均檢測下限為0.05ppb，此濃度之吸光值與陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。

G、 特異性

針對以下抗生素進行交叉反應(yīng)之測試，結(jié)果如下:

Chloramphenicol =100%

Chloramphenicol(free base) <0.1%

Gentamycin <0.1%

Tetracycline <0.1%

Penicillin G <0.1%

Sulfamethazine <0.1%

H、再現(xiàn)性

針對氯霉素檢測試劑盒精密度測試，重復(fù)6次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(%CV).

I、回收率

組織(添加1.0ppb)104~117%

可檢測酶聯(lián)免疫法方法學(xué)、化學(xué)發(fā)光法方法學(xué)實驗項目:

一、孕前優(yōu)生健康檢查項目:

乙型肝炎血清學(xué)五項檢測、梅毒螺旋體篩查、風(fēng)疹病毒IgG抗體測定、巨細胞病毒IgM抗體和IgG抗體測定、弓形體IgM和IgG抗體測定;甲狀腺功能檢測(促甲狀腺激素)

二、TORCH優(yōu)生優(yōu)育系列:

弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒……

三、術(shù)前系列:

乙肝兩對半、丙型肝炎、艾滋病毒、梅毒

四、傳染病系列:

登革熱、流感/副流感、細小病毒、EB病毒、立克次體、幽門螺桿菌、麻疹、腮腺炎、破傷風(fēng)、水痘、錐蟲、包蟲……

五、呼吸道系列:

肺炎支原體、沙眼衣原體、呼吸道合胞病毒、軍團菌、腺病毒、柯薩奇病毒、結(jié)核分枝桿菌……

六、腫瘤標(biāo)記物:

癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原系列CA125/ CA19-9、腫瘤相關(guān)抗原CA242/CA153、人附睪蛋白4(HE4) 、前列腺特異性抗原(PSA)、鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC)、可溶性間皮素相關(guān)肽(SMRP) ……

七、性激素檢測:

睪酮(Tes)、游離睪酮(FT)、孕酮(Pro)、17α-羥孕酮(17α-OHP)、雌二醇(E2)、游離雌三醇(F-E3)、脫氫表雄酮(DHEA) ……

八、甲狀腺系列:

促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、甲狀腺素(T4)、游離甲狀腺素(FT4) 、甲狀腺球蛋白(TG)……

……

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。