冷凍切片機

低溫恒冷箱冷凍切片制作法

以Shandon As 620 E型恒溫箱冷凍切片機為例，該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10分鐘。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15分鐘。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一周的工作或者一天的工作后，啟動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調節(jié)修組織塊時的進退。

冷凍箱內左邊的冷凍臺，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來。

操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。

④調好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調節(jié)上，這就要求操作者要細心，準確地將其調較好，調校至適當?shù)奈恢?。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和淋巴結時，冷凍箱中的溫度不能調太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。

冰凍切片時的注意事項：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。

③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水分就存留于組織中，形成了冰晶。

⑤當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。

⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。

冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼于載玻片后，即用電吹風吹干后再固定。根據(jù)實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內含有的物質由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鐘。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鐘。

④ 分化。

⑤ 于堿水中返藍20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內完成快速制片過程，結果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這里不作闡述。