磷酸酶

半胱氨酸依賴的磷酸酶通過(guò)形成磷酸-半胱氨酸中間體來(lái)催化磷酸酯鍵的斷裂，具體過(guò)程如下(以磷酸化的酪氨酸去磷酸化過(guò)程為例，參見(jiàn)右圖)[1]

首先，酶活性位點(diǎn)上的自由的半胱氨酸親核基團(tuán)進(jìn)攻磷酸基團(tuán)中的磷原子并成鍵;然后，連接磷酸基團(tuán)與酪氨酸的P-O鍵接受位置合適的酸性氨基酸(如天冬氨酸)或水分子所提供的質(zhì)子，發(fā)生質(zhì)子化，從而形成磷酸-半胱氨酸中間體;這一中間體被另一個(gè)水分子所水解，酶的活性位點(diǎn)被釋放，可以繼續(xù)下一個(gè)去磷酸化反應(yīng)。

金屬磷酸酶的活性位點(diǎn)上結(jié)合了兩個(gè)催化所必需的金屬離子。而對(duì)于這兩個(gè)金屬離子的性質(zhì)的研究結(jié)果并不一致，因此到目前為止還沒(méi)有定論。現(xiàn)有的證據(jù)只能夠表明，這兩種金屬可以是鎂、錳、鐵、鋅的任意組合，并且兩個(gè)金屬離子之間通過(guò)一個(gè)氫氧根離子相連。目前認(rèn)為這一氫氧根離子參與了對(duì)磷的親核攻擊。

根據(jù)所催化的底物特異性，磷酸酶可以被細(xì)分為如下五種。

類別 例子 底物

酪氨酸特異性磷酸酶 PTP1B 磷酸化酪氨酸

絲氨酸/蘇氨酸特異性磷酸酶 PP2C 磷酸化絲氨酸/蘇氨酸

雙特異性磷酸酶 VHR 磷酸化酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸

組氨酸磷酸酶 PHP 磷酸化組氨酸

脂類磷酸酶 PTEN 磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Triphosphate)

磷酸酶與激酶或磷酸化酶的磷酸化作用正相反。磷酸化可以使一個(gè)酶被激活或失活(如，激酶信號(hào)通路[7] )，也可以使一個(gè)蛋白-蛋白間相互作用發(fā)生(如SH3結(jié)構(gòu)域);因此，磷酸酶是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制磷酸化所必需的。值得一提的是，磷酸化或去磷酸化并不一定對(duì)應(yīng)著酶的激活或抑制，而且一些酶有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)參與激活或抑制的調(diào)控。例如，周期素依賴性激酶(CDK)有多個(gè)能夠被磷酸化的特定氨基酸殘基，而激活或抑制對(duì)應(yīng)不同殘基的磷酸化。磷酸之所以對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)很重要，其原因在于它能夠?qū)ζ渌Y(jié)合的蛋白的行動(dòng)進(jìn)行調(diào)控;而除去磷酸，則是一種反向作用(如果磷酸化是激活作用，則去磷酸化就是抑制作用)，磷酸酶就在這里扮演了重要的角色。

磷酸酶可以被分為兩類:半胱氨酸依賴的磷酸酶和金屬磷酸酶(其活性依賴位于活性位點(diǎn)上的金屬離子)。

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞的一種外酶，它的表達(dá)活性是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)明顯特征。堿性磷酸酶在機(jī)體中的 主要生理功能是在成骨過(guò)程中水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸，同時(shí)水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)骨鹽形成的抑制作用，有利于成骨作用。

正常范圍

成人40～110U/L；

兒童 （小于10歲）350U/L。

檢查介紹

堿性磷酸酶（ALP或AKP）是一種磷酸單酯酶，血清中ALP來(lái)源于不同的組織（肝、骨、腎、小腸、胎盤(pán)等），主要以游離形式存在，極少量與脂蛋白和免疫球蛋白結(jié)合。正常情況下，體內(nèi)ALP是來(lái)源于肝（肝ALP）和骨（骨ALP ）各半。

臨床意義

某些病理原因（如各種肝、骨等疾病）和生理性原因（如兒童生長(zhǎng)發(fā)育期、妊娠2個(gè)月后等）均可引起血清ALP水平改變，臨床主要為肝膽和骨骼疾病所引起。

代謝異常原因

堿性磷酸酶主要用于阻塞性黃疸、肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查，阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎都會(huì)使堿性磷酸酶偏高。

膽道排泄異常

堿性磷酸酶是需要經(jīng)過(guò)肝臟，然后由膽汁排出，當(dāng)排泄過(guò)程中出現(xiàn)異常，那就會(huì)引起堿性磷酸酶偏高。

骨骼組織原因

由于骨組織中此酶亦很活躍。因此，孕婦、骨折愈合期、骨軟化癥。佝僂病、骨細(xì)胞癌、骨質(zhì)疏松等血清堿性磷酸 酶會(huì)升高。

增高：

肝膽疾病：血清總ALP病理性升高，機(jī)會(huì)60%是由肝臟和膽道疾病引起的。ALP是膽汁淤積性疾病的敏感指標(biāo)。

（1）肝外膽管阻塞：早期ALP即升高，臨床常見(jiàn)：1.胰頭癌、膽管癌等惡性梗阻。ALP顯著增高。2.膽道結(jié)石和炎癥所致良性梗阻，其增高程度低于惡性梗阻。3.膽囊炎、膽石癥、硬化性膽管炎時(shí)，ALP可升高。

（2）肝內(nèi)膽汁淤積：膽汁淤積性肝炎及藥物和乙醇引起的肝內(nèi)膽汁淤積，ALP增高程度往往低于肝外惡性膽道梗阻。

（3）肝內(nèi)占位性病變：原發(fā)性肝細(xì)胞癌時(shí)ALP升高比轉(zhuǎn)氨酶升高明顯；轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌時(shí)可出現(xiàn)大分子量的ALP。

（4）病毒性肝炎、肝硬化等肝實(shí)質(zhì)性病變：如無(wú)膽管系統(tǒng)阻塞和膽汁淤積，ALP一般正?；蜉p微增高。如果同時(shí)有膽管淤積和膽汁淤積發(fā)生，則黃疸的同時(shí)有ALP明顯升高。

其他腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤等，堿性磷酸酶增高時(shí)，提示可能有肝臟轉(zhuǎn)移。

變形性骨炎、成骨細(xì)胞癌、佝僂病、骨軟化、甲狀腺及甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腎小管性酸中毒、遺傳性磷酸酶過(guò)多癥

很多藥物可使堿性磷酸酶增高，如巴比妥類、抗生素（紅霉素、慶大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素等）。

減低：常見(jiàn)于重癥慢性腎炎、乳糜瀉、貧血、惡病質(zhì)、兒童甲狀腺功能不全或減退、維生素C缺乏癥壞血?。?。營(yíng)養(yǎng)不良、呆小癥、遺傳性低磷酸酶血癥。

堿性磷酸酶偏低

兒童ALP活性降低會(huì)影響骨骼發(fā)育，甚至骨骼發(fā)育停止，成為臨床上的呆小癥、軟骨發(fā)育不全及惡質(zhì)??；婦女中以老年婦女ALP活性降低者為多見(jiàn)，可能與老年婦女絕經(jīng)后雌激素分泌減少，影響骨質(zhì)的再吸收，骨質(zhì)疏松使血清ALP活性低下有關(guān)。綜上所述，血清ALP活性降低主要見(jiàn)于重癥慢性腎炎并伴有腎衰、營(yíng)養(yǎng)不良和甲狀腺功能不全、鎂缺乏、乳糜瀉、嚴(yán)重貧血等。還有一種遺傳性低ALP癥，此種嬰兒血清ALP缺乏，成骨細(xì)胞中也缺乏此酶，引起骨中的礦物質(zhì)嚴(yán)重缺乏，易發(fā)生骨折。

當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。

堿性磷酸酶偏高的原因可以分為生理性原因和病理性原因，具體討論如下：

1、生理性原因 兒童骨骼發(fā)育期、孕婦、骨折愈合期，這些情況下骨組織中的堿性磷酸酶很活躍，所以檢測(cè)時(shí)值會(huì)偏高。

2、病理性原因 當(dāng)人體患有阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等時(shí)，肝細(xì)胞過(guò)度制造ALP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于膽汁排泄障礙，反流入血，引起血清中的堿性磷酸酶偏高。

3、骨骼有病時(shí)，例如佝僂病、骨上腫瘤、軟骨病等。

4、其他不是很常見(jiàn)的疾病，例如腎病、嚴(yán)重性貧血、甲狀腺機(jī)能不全、白血病等。

-抗堿性磷酸酶復(fù)合物制備技術(shù)

Mason等(1978)，用堿性磷酸酶代替過(guò)氧化物酶，建立了堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物(APAAP)橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)。但以AP作為抗原用常規(guī)免疫方法制備的抗血清，很難達(dá)到APAPP橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)的質(zhì)量要求，在一定程度上限制了此項(xiàng)技術(shù)的推廣使用。楊志剛等(1989)利用抗AP的McAb建立了一種制備APAAP復(fù)合物的簡(jiǎn)便方法。只需將AP和抗AP的McAb以適當(dāng)比例混合，4℃結(jié)合過(guò)夜即可使用。采用改良的ELISA方法檢測(cè)APAAP復(fù)合中AP的最適含量。具體方法是:用羊抗鼠Ig包被微量滴定板;加入一定量的抗APMcAb;分別加入不同量的AP作用后經(jīng)過(guò)洗滌;加底物顯色，測(cè)定光密度值(OD)。在一定范圍內(nèi)，APAAP復(fù)合物溶液中AP含量增加的同時(shí)，相應(yīng)的OD值也隨之增大;當(dāng)AP增加到一定量時(shí)(約6~8mg/mL)、OD值保持穩(wěn)定。