離子淌度概述

離子淌度質(zhì)譜是離子淌度分離與質(zhì)譜聯(lián)用的一種新型二維質(zhì)譜分析技術(shù)，離子淌度分離原理是基于離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞時的碰撞截面不同，離子可按大小和形狀進行分離。經(jīng)過30多年的發(fā)展，離子淌度質(zhì)譜已配有多種最新的離子源及質(zhì)量分析器，理論研究也日漸成熟，并在蛋白質(zhì)、多肽及復(fù)雜化合物異構(gòu)體分析方面越發(fā)顯示出獨特的優(yōu)勢，正在發(fā)展成為一種新型的重要分析工具。

20世紀(jì)80年代后，由于各種軟電離技術(shù)相繼問世，質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)的應(yīng)用拓展到對高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的生物大分子的分析研究，發(fā)展成為生物質(zhì)譜，并迅速成為現(xiàn)代分析化學(xué)最前沿的領(lǐng)域之一 。離子淌度質(zhì)譜(ion mobility mass spectrometry，IMMS)是離子淌度光譜(ion mobility spectrometry，IMS)技術(shù)與質(zhì)譜的聯(lián)用。是一種新型的二維分離質(zhì)譜技術(shù)。IMS技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，由于其具有多樣性的分析能力、良好的檢測限及實時的檢測能力，在當(dāng)時受到人們廣泛關(guān)注，但由于IMS分辨率較低且不能給出離子質(zhì)量信息，加之當(dāng)時人們對離子組成的重要性缺乏理解，因此在1976年以后，有關(guān)離子淌度的研究逐漸減少。直到20世紀(jì)80年代末，特別是以MALDI和ESI 為代表的各種軟電離方法應(yīng)用以來，IMS在化合物異構(gòu)體分離方面具有的獨到優(yōu)勢才又引起了人們的關(guān)注，相繼推出了配備各種新型離子源的IMS-MS聯(lián)用技術(shù)，精確的離子幾何形狀和淌度計算方法得到飛速發(fā)展，IMMS技術(shù)有了實質(zhì)性進展。目前，IMMS已經(jīng)用來檢測化學(xué)戰(zhàn)劑、爆炸物 、環(huán)境污染 、麻醉劑 、半導(dǎo)體及生物大分子(如肽和蛋白質(zhì)類)，并顯示出其強大的分析能力。

1 原理與儀器組成

1.1 IMMS基本原理

離子淌度(ion mobility，IM)，又稱離子遷移率，是指在電場強度為1 V/m或電場力為1N時正離子或負離子的運動速度，單位為m /V。在IMS中，離子受電場力加速的作用向前運動，運動中又與飄移區(qū)緩沖氣體分子發(fā)生碰撞產(chǎn)生阻力使速度降低。碰撞過程中離子失去的動能可轉(zhuǎn)化為內(nèi)能使離子溫度升高，再次的碰撞又可將升高的內(nèi)能傳遞給氣體分子，回復(fù)到系統(tǒng)溫度 。因此，離子在運動過程中溫度和速度并不保持恒定。離子之間、離子與緩沖氣體之間也可能存在著靜電引力與庫侖斥力，決定了離子在飄移區(qū)的運動過程是極其復(fù)雜的，只能由其平均速度(即離子淌度 )或離子通過飄移區(qū)的時間td來計量。這種分離過程與色譜的分離過程類似，因此IMS在早期又被稱為等離子體色譜(plasmachromatography，Pc)。為了使不同實驗條件下的測量值能夠相互比較，在實際應(yīng)用中通常將離子淌度轉(zhuǎn)換為折合離子淌度(reduced ionmobility， )，即在溫度為273 K，壓力為760 Tort的條件下的離子淌度，離子的大小和形狀可用離子與緩沖氣體發(fā)生碰撞時的平均可用截面即碰撞截面(collision Cross section，n)來衡量。由上述可知，離子淌度分離主要是基于離子的形狀和大小。因此，對于用常規(guī)質(zhì)譜方法不能區(qū)分的異構(gòu)體或復(fù)合物等分析，這種分離手段具有獨特優(yōu)勢。離子按淌度預(yù)分離后，再通過每一組分質(zhì)荷比求得質(zhì)量數(shù)，便可獲得離子淌度質(zhì)譜二維圖譜或三維圖譜(圖1)。

1.2 儀器組成

離子淌度質(zhì)譜儀與常規(guī)質(zhì)譜儀的主要區(qū)別在于前者在離子源和質(zhì)量分析器之間增加了一個離子飄移管。離子飄移管通常由不導(dǎo)電的高純度氧化鋁制成，中間鑲嵌若干不銹鋼環(huán)，不銹鋼環(huán)之間以高溫電阻相連，兩端不銹鋼環(huán)之間施加驅(qū)動離子前進的電場。質(zhì)量分析器可采用四極質(zhì)量分析器或飛行時間質(zhì)量分析器，由于四極分析器掃描離子費時較長，現(xiàn)在IMMS分析器多為飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)。儀器中飄移管部分通以緩沖氣體，質(zhì)量分析器部分采用高真空，二者之間配以由錐體和離子透鏡組成的接口。典型的離子淌度質(zhì)譜的組成見圖2。由于離子在飄移管中通過的時間為毫秒級，在飛行管中通過時間為微秒級，在下一組分到來前有充足的時間求得離子的質(zhì)量數(shù)，因此對每一組分可在一次實驗中同時求得淌度和質(zhì)量數(shù)，整個實驗可在1 min內(nèi)完成。

有時為了獲得更多的離子信息，可在飄移管前和(或)后串聯(lián)使用幾種質(zhì)量分析器，如離子阱或四極濾質(zhì)器等。

2 離子淌度理論的研究進展

2.1 緩沖氣體對碰撞截面的影響

IMS區(qū)分離子是通過與緩沖氣體分子碰撞過程而實現(xiàn)的，緩沖氣體的種類直接影響分離過程。氮氣和氦氣是最常用的兩種氣體，氮氣一般用于常規(guī)分析，氦氣常用于結(jié)構(gòu)分析。其他氣體還有二氧化碳、六氟化硫、氨 和四氟化碳 。使用不同緩沖氣體的理論研究在1975年之后便很少，即使是現(xiàn)在也還沒有引起人們足夠的重視，但在實際應(yīng)用中，使用不同的氣體對獲得良好的分辨率和檢測靈敏度相當(dāng)重要。

離子的碰撞截面不僅與緩沖氣體的質(zhì)量數(shù)有關(guān)，而且取決于緩沖氣體極化率的大小 。Matz等 研究6種苯丙胺(安非他明)衍生物在氦氣、氬氣、氮氣與二氧化碳4種不同緩沖氣體下的碰撞截面，結(jié)果顯示碰撞截面隨緩沖氣體質(zhì)量數(shù)的上升而上升，但并無嚴格的線性關(guān)系。而極化率與碰撞截面之間有良好的線性關(guān)系，碰撞截面隨極化率的上升而上升，這也說明碰撞截面更依賴于緩沖氣體的極化率而不是質(zhì)量數(shù)。Els等 研究了不同濃度的氮氣/二氧化碳混合氣體作為緩沖氣體在l0 水平分離5種氯代和溴代乙酸的情況，使用100% 氮氣，2種組分淹沒在其他峰中，若在緩沖氣體中加入3%二氧化碳，則能達到完全分離，表明載氣的組成明顯影響峰形的檢出。

2.2 離子淌度與質(zhì)荷比的關(guān)系

IMS分辨率較低，即使是高分辨IMS也只能達到與常規(guī)HPLC相同或稍高的分辨能力，這使其單獨分離復(fù)雜混合物變得困難。在IMS發(fā)明之初，研究者就試圖通過建立 與m/z的關(guān)系，由 推知離子的質(zhì)量數(shù)。但大量實驗數(shù)據(jù)表明， 與m/z之間只是一種粗略的線性趨勢，遠遠不能滿足人們對離子質(zhì)量數(shù)的精確要求，IMS在質(zhì)荷比(m/z)

IMMS中只能作為一種前質(zhì)量分析器。盡管有的物質(zhì)能夠通過單一的離子淌度技術(shù)快速鑒別開來，但IMMS能夠提供的二維"淌度/質(zhì)量"模式能夠達到對復(fù)雜混合物的高分辨分離。在二維IMMS(2-D IMMS)中，不同電荷的離子其"淌度/質(zhì)量"線性趨勢明顯不同，通過對復(fù)雜產(chǎn)物的2-D數(shù)據(jù)進行分析，找出其不同的"淌度/質(zhì)量"關(guān)系已經(jīng)成為鑒定和解釋這些產(chǎn)物的一種重要技術(shù)。Clemmer等已經(jīng)通過 與m/z趨勢關(guān)系鑒別了低淌度(單電荷)和高淌度(雙電荷)的兩組肽混合物 J。Russel等使用內(nèi)標(biāo)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù) 與m/z關(guān)系將蛋白質(zhì)酶解后的肽混合物分開 。Stciner 利用ESI-API-IM-TOF-MS分析水溶性化學(xué)戰(zhàn)劑降解產(chǎn)物，使用相同系列的n一烷基胺作為基線標(biāo)準(zhǔn)，利用不同降解產(chǎn)物的與m/z趨勢使其得到鑒定。

離子淌度的測定受各種因素的影響，如電噴霧溶劑組成、飄移區(qū)溫度、噴霧電壓、溶劑流速、緩沖氣體流速、冷卻氣體流速等諸多因素影響。

2.3 離子電荷、取代基與碰撞截面的關(guān)系

盡管還沒有方法證明氣相離子和溶液中離子的結(jié)構(gòu)之間有如何緊密的關(guān)系，但精確測量離子的碰撞截面還是能提高對肽、蛋白質(zhì)等復(fù)雜物質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解。離子中原子間氫鍵和范德華力使其呈現(xiàn)折疊和緊湊狀態(tài)，電荷和庫侖斥力則克服離子內(nèi)的相互吸引而使分子呈現(xiàn)松散狀態(tài)。Kindy等利用同位素標(biāo)記研究了3種蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)單乙?；亩蔚呐鲎步孛姹任匆阴；囊叱?5% ~35% ;雙乙?；脑黾痈啵@種增加(特別對大的肽段)遠遠大于乙?；捏w積增大因素，表明乙?；哂袑﹄碾x子整體結(jié)構(gòu)改變的特殊作用。Badman等 叫研究了泛素從ESI進入IM管過程中碰撞截面的變化過程，認為離子進入飄移管的初期均為緊湊結(jié)構(gòu)，受加速電壓的作用才快速伸展成開放結(jié)構(gòu)。

離子中電荷的位置和數(shù)量是影響氣相離子碰撞截面的重要參數(shù)。Wu等 研究了強啡肽A的3個片段F7(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg)、F8(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg一Ⅱe)、F、9(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-He-Arg)帶1-3個電荷時的碰撞截面變化情況，結(jié)果見表1。單電荷和雙電荷的碰撞截面從F7至F、9增加值穩(wěn)定在約9% ，這可用在C端增加一個氨基酸的"大小效果"很好地解釋。另外，所有3種肽從單電荷到雙電荷碰撞截面的增加都保持在相似的7% 一8%水平。隨著電荷的增加，庫侖斥力增加使肽呈現(xiàn)更松散狀態(tài)。然而，在F7和F8中引入第3個電荷，卻使碰撞截面急劇上升，這是因為在這些肽中只存在3個堿性位點，相鄰的兩個精氨酸殘基必須同時質(zhì)子化，急劇增加的庫侖斥力能使得離子以一種更加伸展的狀態(tài)存在，而使碰撞截面急劇增加。F、9離子增加不顯著是因為末端精氨酸殘基的存在可以避免兩個相鄰氨基酸均被質(zhì)子化。Badman等 總結(jié)了1996-2001年間發(fā)表的細胞色素e氣態(tài)離子碰撞截面的數(shù)據(jù)，所帶電荷從+3至+20，雖然同電荷離子的碰撞截面數(shù)值稍有不同，但均表現(xiàn)為隨電荷的增加而增加，增加幅度也極為相似。

利用碰撞截面最具優(yōu)越性的地方在于區(qū)別具有相同電荷、相似質(zhì)量的不同離子或質(zhì)量數(shù)相同的異構(gòu)體離子。Hen.derson等 研究了細胞色素c兩個酶解碎片IFVQK.CAQCHTVEK(相對分子質(zhì)量為1 633.820)和heme.CAQCHTVEK(相對分子質(zhì)量為1 633.615)，二者具有極為相似的質(zhì)量數(shù)，在序列已知的情況下，利用軟件模擬其電荷分布情況，分別計算其所需的碰撞截面和加速電壓，測量其離子淌度，求出碰撞截面并與計算值相比較，從而區(qū)分兩種碎片，結(jié)果顯示兩個碎片均帶兩個電荷，分別為I rVQK-CAQCHTVEK 和heme-C"AQCHTVEK (上標(biāo)為質(zhì)子化位置)。

文獻[35]列出了34種常見蛋白質(zhì)酶解后的660種肽離子的碰撞截面數(shù)據(jù)，并從統(tǒng)計學(xué)角度在理論上分析了氨基酸殘基的內(nèi)在形狀參數(shù)與碰撞截面的關(guān)系，從而可通過氨基酸序列預(yù)測肽離子的碰撞截面。文獻[36]也有類似報道。

3 展望

質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)今分析化學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一。離子淌度質(zhì)譜結(jié)合了離子淌度技術(shù)靈敏、快速、能夠提供離子結(jié)構(gòu)信息和質(zhì)譜能夠提供準(zhǔn)確質(zhì)量信息的特點，在化合物異構(gòu)體分析、生物大分子相互作用分析等方面正顯示出越來越多的優(yōu)越性。目前國內(nèi)有關(guān)離子淌度質(zhì)譜的報道很少，國外也僅有為數(shù)不多的科研機構(gòu)進行離子淌度質(zhì)譜的研究。目前離子淌度質(zhì)譜儀還沒有上市，還有一些需要解決的問題，但經(jīng)過30多年的發(fā)展，其理論研究已近成熟，儀器已配備了MALDI和ESI等新型離子源，有些還同時串聯(lián)了四極桿質(zhì)譜和(或)離子阱質(zhì)譜，具有更低的檢測限和更高的靈敏度和分辨率。可以相信，在不久的將來，離子淌度質(zhì)譜會成為功能基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以及藥學(xué)、醫(yī)學(xué)和化工等領(lǐng)域不可缺少的重要工具。