凝膠電泳儀科學(xué)原理

以凝膠(如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠

等)為支撐物的區(qū)帶電泳。

生物化學(xué)與分子生物學(xué)（一級學(xué)科）；方法與技術(shù)（二級學(xué)科） 。

該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術(shù)操作。

凝膠電泳被廣泛用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)：1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）分離，也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。2.蛋白質(zhì)的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行（SDS-PAGE），或者非變性凝膠電泳，或二維電泳。 SDS-PAGE 蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。 3.毛細(xì)管電泳 　4.酶譜

法（zymography） 5.變性梯度膠凝電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） 瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、 DNA的分子大小: 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、 瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、DNA分子的構(gòu)象

DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、 DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、 瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、 DNA分子的構(gòu)象

DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

4、 電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15%。

6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 　對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。

電腦三恒多用電泳儀-DYY-12;電腦三恒多用電泳儀-DYY-11;電腦三恒多用電泳儀-DYY-12C;半干式碳板轉(zhuǎn)印電泳儀(槽);DNA回收電泳儀(槽)DYCP-43B型等。

按支持物的物理性狀不同,電泳可分為

(1)濾紙為支持物的紙電泳

(2)粉末電泳: 如纖維素粉,淀粉,玻璃粉電泳

(3)凝膠電泳:如瓊脂,瓊脂糖,硅膠,淀粉膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳

(4)緣線電泳:如尼龍絲,人造絲電泳

1. 電泳儀的輸出達(dá)不到設(shè)定值

電泳儀的輸出值狀態(tài)遵循“歐姆定律”：電壓U=電流I×(電泳槽)電阻R

電阻R相對不變的情況下，U、I、P(功率P=電流I×電壓U)中任意1個(gè)參數(shù)恒定，其他參數(shù)也隨之恒定；而任意1個(gè)參數(shù)變化，其他參數(shù)也隨之正比變化。

如果電泳儀的輸出電壓U達(dá)不到預(yù)置值，應(yīng)首先觀察I或P是否已經(jīng)恒定，或者已經(jīng)達(dá)到電泳儀所規(guī)定的最大I或P(JY電泳儀均有明確指示燈標(biāo)志)。如果尚未達(dá)到極限值，將已經(jīng)恒定I或P的設(shè)置調(diào)大(有必要的話至極限值)，才能夠提高電壓輸出。

如果電泳儀的電流I達(dá)不到預(yù)置值，可調(diào)整電壓U或功率P。如果電泳儀的功率P達(dá)不到預(yù)置值，可調(diào)整電壓U或電流I。

2. 電腦控制電泳儀過壓報(bào)警

1）檢查是否空載使用。

2）是否電泳槽未加緩沖液。

3）是否電泳槽鉑金絲斷。

3. 過流保護(hù)

1）是否存在電泳槽短路現(xiàn)象。

2）緩沖液是否選錯(cuò)。

4. 漏電保護(hù)

1）是否有液體濺入儀器內(nèi)部或輸出接口上。

2）是否有很多灰塵落入儀器內(nèi)部。

電泳儀是實(shí)現(xiàn)電泳分析的儀器。電泳是一種帶電分子在電場中向著電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)，稱電泳技術(shù) 。

1. 首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。

2. 電泳儀電源開關(guān)調(diào)至關(guān)的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。

3. 接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達(dá)到的所需電壓為止，設(shè)定電泳終止時(shí)間，此時(shí)電泳即開始進(jìn)行。

4. 工作完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。