色譜柱發(fā)展方向

因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是:①節(jié)省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達(dá)到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。

但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能:輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。

1、首先應(yīng)確認(rèn)柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。為減少死體積，進(jìn)樣閥、柱子、檢測器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線，同時(shí)控制進(jìn)樣器、色譜柱和檢測器之間連接管線的長度。安裝色譜柱之前，確認(rèn)流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。對分析較復(fù)雜的樣品建議安裝保護(hù)柱。

2、為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達(dá)最佳的連接效果，應(yīng)盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來的接頭長期匹配其他類型的色譜柱，建議在連接新色譜柱前應(yīng)檢查匹配情況，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的漏液。

3、使用PEEK 材料的通用接頭，只需用手?jǐn)Q緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi;使用溫度不得超過100℃。

1、在進(jìn)行樣品檢測前，至少使用20倍柱體積流動相使色譜柱充分平衡。流動相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用水相的緩沖液應(yīng)當(dāng)天配制以保持新鮮避免細(xì)菌產(chǎn)生。

2、流動相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動相中顆粒對色譜系統(tǒng)和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動相混合后應(yīng)重新過濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。不應(yīng)使用純水作為流動相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞(添加5%的有機(jī)溶劑沖洗色譜柱，同時(shí)可以達(dá)到對緩沖鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡)。

3、流動相需脫氣后使用，可避免因氣泡導(dǎo)致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時(shí)使用的流動相與色譜柱保存使用的流動相有較大區(qū)別，應(yīng)該使用過度分布的形式進(jìn)行平衡。避免由于流動相的突然變化造成柱壓增加過大或流動相緩沖鹽結(jié)晶造成對色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長的平衡時(shí)間。

1、樣品應(yīng)當(dāng)盡可能溶解在能與流動相相互溶的溶劑中。除特殊指明外，如使用強(qiáng)溶劑溶解樣品柱子的分辨率將可能降低。

2、樣品溶液在進(jìn)樣前應(yīng)使用針頭式過濾器對樣品預(yù)先過濾。頻繁改變流動相組成，會加速降低柱效。

3、色譜柱由高壓勻漿法裝填，能承受較高壓力。為獲得最佳分離效果，使用時(shí)請不要超過200kgf，而且避免壓力突然上升或變化，否則會造成硅膠填料的破壞，減少色譜柱的使用壽命。除特殊要求外最高操作溫度不要超過60℃。

1、如果流動相含有酸或無機(jī)鹽，應(yīng)當(dāng)先用去離子水(20倍柱體積)沖洗干凈。然后用用100%乙腈或甲醇保存色譜柱。最后用柱子的接頭密封，并放在穩(wěn)定的環(huán)境中存放。

2、應(yīng)避免色譜柱受到直接的機(jī)械沖擊或摔落，避免造成色譜柱性能的降低。

色譜柱的再生:

用相當(dāng)于20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子，建議按柱子的箭頭方向沖洗，盡可能不反沖。沖洗時(shí)使用的的參考溶劑順序是水、甲醇、氯仿、異丙醇。

常見的分配柱填料:碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(MOS/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、

碳四柱(Butyl/C4)、碳一柱(Methyl/C1)、陰離子交換柱(SAX)、

陽離子交換柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、

氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)

常見的吸附柱填料:硅膠柱

色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同:①常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm)，柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn)，內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm;③毛細(xì)管柱(又稱微柱microcolumn)，內(nèi)徑0.2~0.5mm;④半制備柱，內(nèi)徑>5mm;⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm;⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

chromatographic column

裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。

多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。

色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。液相色譜通常均采用填充柱。

色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度>20um時(shí)，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20um時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters專利;③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。

① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)。

② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>

③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。

④ 選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

⑥ 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇(乙腈)沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200&micro;l四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。

陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機(jī)物)、甲醇、水依次沖洗。

⑦ 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。

⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30mm)，可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會損失一定的柱效，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀Ｐ碌纳V柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。

每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘。

一、石墨化碳填料

硅膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差，僅能在pH=2~8的環(huán)境下工作。但是，在很多場合下，需要使用極端的pH條件。為此，人們曾大力發(fā)展高分子微球、氧化鋁、氧化鋯等化學(xué)穩(wěn)定性更好的基質(zhì)材料。但是，很難有一種材料能全面地滿足液相色譜基質(zhì)的要求。例如，高分子微球在有機(jī)溶劑中會發(fā)生一些溶脹，因此難以應(yīng)用于以含有機(jī)溶劑的流動相進(jìn)行梯度淋洗的場合;氧化鋁和氧化鋯與硅膠相比，雖然化學(xué)穩(wěn)定性較好，但其表面修飾與鍵合比較困難。因此，化學(xué)穩(wěn)定性好的碳材料便很自然地被考慮作為色譜填料的基質(zhì)。

碳材料有極好的化學(xué)穩(wěn)定性，可耐受寬達(dá)pH=1~14的環(huán)境;耐高溫，石墨化碳可耐3000℃以上的高溫而不受破壞;經(jīng)適當(dāng)加工的碳材料可具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性及電磁屏蔽特性。更為難能可貴的是，多孔性碳材料以其結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)而具有很好的吸附性及選擇性。正是碳材料的這些特性，使人們期待它在色譜領(lǐng)域中能有特殊的用途。

二、貫流色譜填料

貫流色譜是20世紀(jì)80年代末至90年代初發(fā)展起來的一種色譜分離新方法。在這種填料上，既有通常的微孔或大孔，例如50~150nm的微孔，又有貫穿整個(gè)顆粒的，孔徑約600~800nm超大孔存在。這種貫穿的大孔，可以允許流動相直接進(jìn)入填料顆粒的內(nèi)部并貫穿而過。這樣，就相當(dāng)于極大地降低了填料顆粒的直徑，即以貫穿孔將填料分割成了很多更細(xì)小的顆粒，在這種小顆粒上的微孔已經(jīng)短到不對傳質(zhì)過程構(gòu)成明顯的阻力。因此，在這種貫流色譜填料上，傳質(zhì)阻力已經(jīng)非常小。同時(shí)，貫穿孔內(nèi)流動相的線速度正比于柱子中流動相的速度，即傳質(zhì)過程已由擴(kuò)散傳質(zhì)變?yōu)閷α鱾髻|(zhì)。這就意味著，在一定范圍內(nèi)，及時(shí)提高流動相速度，也不會降低柱子的分離效率。由于填料上同時(shí)還存在有通常的多孔結(jié)構(gòu)，其比表面積并未隨貫穿孔的出現(xiàn)而大幅度降低。

因此，在這種填料上的樣品負(fù)載量也不隨流速的增加而減少。再者，填料上600~800nm的貫穿孔，極大地增加了柱子的通透性，使得這種柱子即使工作于很高的流速下，其操作壓力也不需要很高。所以，這種貫流色譜柱可以同時(shí)具有高流速、高效率、高樣品負(fù)載量和低操作壓力的特點(diǎn)。

三、整體柱

整體柱又稱整體固定相、棒柱、連續(xù)床等，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化，是一種新型的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成，分離在樣品流經(jīng)孔結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)生?？梢詼p少路徑的差異和縱向擴(kuò)展。

整體柱的優(yōu)點(diǎn)包括:可以原位制備，省去制備填料和裝柱，也可以同法制成聚合物顆粒后再裝柱;聚合物易于制備，柱子的長度和直徑在一定程度上不受限制;聚合反應(yīng)混合物中的單體可以靈活選擇以得到適合的基質(zhì)和性質(zhì);易于在柱衍生化，以得到具有合適性質(zhì)的色譜柱;通過控制聚合反應(yīng)的條件可以優(yōu)化孔的性狀。

在高效液相色譜分析系統(tǒng)中，對色譜柱溫度控制的要求越來越高，藥典及諸多新的分析方法，也對柱溫給出條件，由于色譜柱恒溫箱(液相色譜柱柱溫箱)可以精確、穩(wěn)定的控制色譜柱的使用溫度，對于提高色譜柱的柱效，改善色譜峰的分離度，縮短保留時(shí)間，降低反壓，保證分析樣品結(jié)果的重復(fù)性，具有不可忽視的作用。使其成為高效液相色譜儀的重要配套裝置。

DT系列色譜柱恒溫箱(液相色譜柱柱溫箱)引進(jìn)國外先進(jìn)的溫度控制技術(shù)和關(guān)鍵的控制元器件，各項(xiàng)性能均達(dá)到國外同類型儀器的指標(biāo)，而性能價(jià)格比遠(yuǎn)優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品。

功 能 特 點(diǎn):

溫度控制采用國際先進(jìn)微處理機(jī)芯片，精度高而穩(wěn)定。

高靈敏度溫度傳感器，確保了自整定功能(PID)和實(shí)時(shí)指示的準(zhǔn)確性。

雙行數(shù)字顯示，觸摸型開關(guān)，使設(shè)定溫度和控制操作簡便易行。

快捷的安裝方式:磁力吸合加熱腔蓋與柱箱蓋

方便的觀察方式:加熱腔上的玻璃透窗可使您方便地從加熱腔外部觀察色譜柱的工作狀況

DT-230A外觀設(shè)計(jì)簡潔大方，符合國際潮流;可臥、可立突出人性化特點(diǎn)。

DT-230B臥式設(shè)計(jì)，可安裝進(jìn)樣閥?？梢苑胖?-4支色譜柱3根半制備柱或凝膠柱.

DT-230C臥式設(shè)計(jì)，可以放置1-4支色譜柱或1-3支(半)制備柱或凝膠柱。

技 術(shù) 指 標(biāo):

● 恒溫誤差:±0.1℃ ; ● 絕對精度:50℃時(shí)±0.1℃ ; ●溫度范圍:室溫-150℃