沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)教程

第一篇沼氣發(fā)酵工藝參數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)1沼氣發(fā)酵原料和料液的總固體（TS）含量測(cè)定2

實(shí)驗(yàn)2原料和料液的揮發(fā)性固體（VS）含量和灰分測(cè)定5

實(shí)驗(yàn)3溶解氧（DO）測(cè)定——碘量法7

實(shí)驗(yàn)4CODCr測(cè)定11

實(shí)驗(yàn)5BOD5的測(cè)定15

實(shí)驗(yàn)6總有機(jī)碳（TOC）的測(cè)定21

實(shí)驗(yàn)7氨態(tài)氮（NH 4N）的測(cè)定26

實(shí)驗(yàn)8總氮（N）素的測(cè)定30

實(shí)驗(yàn)9磷和總磷的測(cè)定36

實(shí)驗(yàn)10鈣（Ca2 ）的測(cè)定——EDTA滴定法46

實(shí)驗(yàn)11鉀（K ）的測(cè)定——四苯硼鈉法53

實(shí)驗(yàn)12鐵（Fe）的測(cè)定——鄰菲啰啉比色法61

實(shí)驗(yàn)13氧化還原電位測(cè)定法68

實(shí)驗(yàn)14沼氣發(fā)酵原料和料液的pH值測(cè)定73

實(shí)驗(yàn)15產(chǎn)CH4菌的MPN法計(jì)數(shù)77

實(shí)驗(yàn)16燃燒熱測(cè)定81

參考文獻(xiàn)87

第二篇沼氣發(fā)酵中基礎(chǔ)物質(zhì)及相關(guān)活性生物物酶測(cè)定

實(shí)驗(yàn)17還原糖與總糖的分析測(cè)定94

實(shí)驗(yàn)18淀粉分解酶的測(cè)定分析104

實(shí)驗(yàn)19蔗糖酶的測(cè)定分析111

實(shí)驗(yàn)20半纖維素的分離提取與分析測(cè)定114

實(shí)驗(yàn)21半纖維素酶（木聚糖酶）的分析測(cè)定127

實(shí)驗(yàn)22纖維素的分析測(cè)定139

實(shí)驗(yàn)23纖維素降解酶的分析測(cè)定145

實(shí)驗(yàn)24木質(zhì)素的分離提取與分析測(cè)定153

實(shí)驗(yàn)25木質(zhì)素降解酶的分析測(cè)定165

實(shí)驗(yàn)26脫氫酶的分析測(cè)定186

實(shí)驗(yàn)27蛋白質(zhì)與蛋白酶的分析測(cè)定193

實(shí)驗(yàn)28沼氣發(fā)酵中氣體成分測(cè)定方法202

參考文獻(xiàn)204第三篇沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)29農(nóng)作物秸稈及畜禽糞便批量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)214

實(shí)驗(yàn)30農(nóng)作物秸稈及畜禽糞便連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)217

實(shí)驗(yàn)31厭氧污泥的產(chǎn)甲烷活性測(cè)定221

實(shí)驗(yàn)32厭氧生物可降解性測(cè)定226

實(shí)驗(yàn)33產(chǎn)甲烷毒性的測(cè)定230

實(shí)驗(yàn)34反應(yīng)器內(nèi)污泥量的測(cè)定237

實(shí)驗(yàn)35生物化學(xué)甲烷勢(shì)的測(cè)定239

實(shí)驗(yàn)36UASB反應(yīng)器處理有機(jī)廢水實(shí)驗(yàn)240

參考文獻(xiàn)244

雖然早在1630年比利時(shí)布魯塞爾的醫(yī)生Van Helment就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了沼氣，但對(duì)沼氣發(fā)酵的科學(xué)認(rèn)識(shí)卻始于1901年。百年來(lái)，沼氣的發(fā)展十分迅速，沼氣微生物的研究從技術(shù)方法、群體代謝、個(gè)體水平到分子生物學(xué)、基因研究、Methanococcus jannaschii全基因組序列的測(cè)定，沼氣發(fā)酵從工藝過(guò)程到設(shè)備配套技術(shù)，沼氣技術(shù)的應(yīng)用從廢棄物能源利用到環(huán)境和生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展等方面均取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。

在產(chǎn)甲烷菌的研究方面，個(gè)體產(chǎn)甲烷菌的分類地位逐漸提高，短短幾十年，產(chǎn)甲烷菌由一個(gè)科上升至5目、10科、26屬；對(duì)產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、膜質(zhì)成分、16S rRNA親緣關(guān)系、7種輔酶因子形成甲烷的機(jī)制等的揭示，改變了種系發(fā)生的傳統(tǒng)二分法理論，提出了生命三領(lǐng)域?qū)W說(shuō)(Three Domains Theory)：古核生物(arachaea)、細(xì)菌(bacteria)和真核生物(eucarya)。在沼氣發(fā)酵的工藝方面，從簡(jiǎn)單的沼氣發(fā)生器出現(xiàn)后，先后又提出和發(fā)展了一系列工藝技術(shù)，如高速消化器、厭氧接觸消化器、UASB、AF、兩相厭氧消化器、厭氧流化床和厭氧膨脹床等，這些技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用拓寬了厭氧消化技術(shù)的服務(wù)范圍，大大提高了厭氧消化的效率。從能源的開發(fā)與利用來(lái)看，沼氣技術(shù)利用有機(jī)廢棄物生產(chǎn)能源，即在有效治理有機(jī)污染的同時(shí)開發(fā)清潔能源；這種能源開發(fā)利用方式能夠保持大氣中二氧化碳的循環(huán)，或二氧化碳零排放。

沼氣發(fā)酵系統(tǒng)涉及內(nèi)容廣泛，理論、應(yīng)用與實(shí)踐共同發(fā)展，多學(xué)科交叉與滲透十分突出，沼氣的推廣應(yīng)用涉及多部門間的合作與協(xié)調(diào)。既有基礎(chǔ)微生物學(xué)、分子生物學(xué)研究，又有發(fā)酵工程的內(nèi)容；既有工藝學(xué)的研究，又有工程的建筑與設(shè)計(jì)；既有微生物代謝與代謝產(chǎn)物的研究，又有沼氣發(fā)酵殘留物的各種綜合利用；既有廢物的處理與能源利用，又有環(huán)境與生態(tài)工程的實(shí)踐；既有以沼氣為紐帶的可持續(xù)農(nóng)業(yè)理論探索，又有各種生態(tài)農(nóng)業(yè)模式的涌現(xiàn)；既有農(nóng)村家用沼氣池的應(yīng)用，又有大中型沼氣工程的運(yùn)行；既有禽畜場(chǎng)大中型沼氣工程、工廠有機(jī)廢水處理沼氣工程，又有城鎮(zhèn)生活污水沼氣凈化工程。

沼氣發(fā)酵是生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化的有效形式之一，特別是對(duì)于解決農(nóng)村能源以及治理有機(jī)廢物和廢水環(huán)境污染等問(wèn)題具有重要的作用。我國(guó)農(nóng)村沼氣30多年來(lái)的實(shí)踐表明，沼氣在解決我國(guó)農(nóng)村能源方面發(fā)揮著積極的甚至是不可替代的作用；以沼氣為紐帶的生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)，取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，南方“豬沼果”、北方“四位一體”、西北“五配套”生態(tài)模式有力地促進(jìn)了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展；“三結(jié)合”、“一池三改”的農(nóng)村沼氣建設(shè)，改善了農(nóng)村環(huán)境衛(wèi)生，整治了村容村貌，有效地促進(jìn)了新農(nóng)村的建設(shè)。我國(guó)農(nóng)村沼氣建設(shè)成功的經(jīng)驗(yàn)已被世界所認(rèn)識(shí)，在發(fā)達(dá)國(guó)家資金的扶持下，發(fā)展中國(guó)家農(nóng)村沼氣建設(shè)正在蓬勃發(fā)展，2008年荷蘭政府啟動(dòng)了非洲沼氣行動(dòng)計(jì)劃，荷蘭政府在全球籌資20億歐元，將用十年的時(shí)間在非洲建設(shè)200萬(wàn)個(gè)農(nóng)村家用沼氣池；亞洲銀行出資，其中2/3是補(bǔ)助資金，1/3是貸款，支持亞洲發(fā)展150萬(wàn)個(gè)農(nóng)村家用沼氣池。

20世紀(jì)80年代以來(lái)厭氧消化技術(shù)應(yīng)用于有機(jī)廢水的處理，各種厭氧消化工藝趨于成熟和高效，在污水處理方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。面對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)大量的糞便廢水，最有效的處理方法就是厭氧消化，這種處理方式實(shí)現(xiàn)了糞便廢水的資源化利用，在環(huán)境污染的治理中獲得較好的經(jīng)濟(jì)收益。以沼氣工程為紐帶，將污染治理轉(zhuǎn)化為資源開發(fā)的優(yōu)勢(shì)，用環(huán)保治理拉動(dòng)企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，使環(huán)保產(chǎn)業(yè)作為產(chǎn)業(yè)建立的基礎(chǔ)，建立飼料(feed)、肥料(fertilizer)、食品(food)和能源/燃料(fuel)的4F循環(huán)經(jīng)濟(jì)模式，最終獲得能源、社會(huì)、生態(tài)/環(huán)境和經(jīng)濟(jì)四大效益，實(shí)現(xiàn)區(qū)域的可持續(xù)發(fā)展。

截至2011年底，全國(guó)戶用沼氣達(dá)到3996萬(wàn)戶，占鄉(xiāng)村總戶數(shù)的23%，受益人口達(dá)15億多人；中央支持建成了24萬(wàn)處小型沼氣工程和3690多處大中型沼氣工程，多元化發(fā)展的新格局初步形成；全國(guó)鄉(xiāng)村服務(wù)網(wǎng)點(diǎn)達(dá)到9萬(wàn)個(gè)、縣級(jí)服務(wù)站800多個(gè)，服務(wù)沼氣用戶3000萬(wàn)戶左右，覆蓋率達(dá)到75%，以沼氣設(shè)計(jì)、沼氣施工、沼氣服務(wù)、沼氣裝備和“三沼”綜合利用為主要內(nèi)容的產(chǎn)業(yè)化體系初步建立。農(nóng)村沼氣從小工程做成了大產(chǎn)業(yè)，把小環(huán)境變成了大生態(tài)，由小項(xiàng)目形成了大事業(yè)。通過(guò)發(fā)展農(nóng)村沼氣，有效防止和減輕了畜禽糞便排放和化肥農(nóng)藥過(guò)量施用造成的面源污染，對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)節(jié)本增效、循環(huán)發(fā)展，提高農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力和競(jìng)爭(zhēng)力發(fā)揮了重要作用；增強(qiáng)了應(yīng)對(duì)氣候變化和保障能源安全的能力，對(duì)減少化石能源消耗、改善農(nóng)村用能結(jié)構(gòu)和應(yīng)對(duì)氣候變化發(fā)揮了不可替代的作用；實(shí)現(xiàn)了糞便、秸稈、有機(jī)垃圾等農(nóng)村主要廢棄物的無(wú)害化處理、資源化利用，使困擾新農(nóng)村建設(shè)的諸多“臟亂差”環(huán)境問(wèn)題得到了有效解決，提高了農(nóng)民生活質(zhì)量，改善了農(nóng)業(yè)農(nóng)村生產(chǎn)生態(tài)環(huán)境，成為了新時(shí)期重要的農(nóng)村民生工程和新農(nóng)村建設(shè)的一大亮點(diǎn)。

目前，許多大專院校的農(nóng)業(yè)工程專業(yè)，均開設(shè)了沼氣技術(shù)相關(guān)的課程，而沼氣技術(shù)本身是一門實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐較強(qiáng)的專業(yè)課，從課程建設(shè)來(lái)看，國(guó)內(nèi)沒有一本關(guān)于沼氣實(shí)驗(yàn)方面的教材，我們將多年碩士研究生的教學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整理，并參考相關(guān)書籍編寫了《沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)教程》。該書具有較強(qiáng)的專業(yè)特色，主要是針對(duì)碩士研究生專業(yè)學(xué)習(xí)與完成研究論文而編寫，同時(shí)兼顧相關(guān)生物質(zhì)能專業(yè)的本科生學(xué)習(xí)與基本技能訓(xùn)練，對(duì)相關(guān)專業(yè)的博士研究生也具有資料豐富性、內(nèi)容新穎性和思考題啟發(fā)性的參考價(jià)值。應(yīng)用該書的人員除具備一定的化學(xué)基礎(chǔ)外，還需具備一定的生物化學(xué)與微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的整體，思考題則多以具體研究設(shè)計(jì)形式出現(xiàn)，要求理論與實(shí)際相結(jié)合，用提示的方式給出現(xiàn)階段技術(shù)可行的參考方法與思考。該書不僅是碩士研究生與本科生教學(xué)的參考用書，對(duì)于高等院?？蒲性核目萍既藛T與博士研究生也有參考價(jià)值和一定的指導(dǎo)意義。可供從事生物質(zhì)能和環(huán)境治理以及農(nóng)、林、牧行業(yè)的相關(guān)研究與開發(fā)人員借鑒。

雖然《沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)教程》是根據(jù)多年的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，并參考了大量的文獻(xiàn)資料，但終因水平有限，疏漏之處一定不少，懇請(qǐng)讀者批評(píng)指正。

張無(wú)敵于云南師范大學(xué)

2013年8月2100433B

1.該書是全國(guó)農(nóng)業(yè)工程方面、生物質(zhì)沼氣利用方面的首部沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)教程.

2.內(nèi)容包括沼氣發(fā)酵中的各種實(shí)驗(yàn)，對(duì)研究生、本科生及生物質(zhì)能等利用開發(fā)人員有較好的參考作用。

沼氣發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，具有以下特點(diǎn) ：

（1）參與發(fā)酵反應(yīng)的微生物種類繁多，沒有應(yīng)用單一菌種生產(chǎn)沼氣的先例，在生產(chǎn)和試驗(yàn)過(guò)程中需要用接種物來(lái)發(fā)酵。

（2）用于發(fā)酵的原料復(fù)雜，來(lái)源廣泛，各種單一的有機(jī)質(zhì)或混合物均可作為發(fā)酵原料，最終產(chǎn)物都是沼氣。此外，通過(guò)沼氣發(fā)酵能夠處理COD質(zhì)量濃度超過(guò)50000mg/L的有機(jī)廢水和固體含量較高的有機(jī)廢棄物。

（3）沼氣微生物自身能耗低，在相同的條件下，厭氧消化所需能量?jī)H占好氧分解的1/30~1/20。

（4）沼氣發(fā)酵裝置種類多，從構(gòu)造到材質(zhì)均有不同，但各種裝置只要設(shè)計(jì)合理均可生產(chǎn)沼氣。

（5）產(chǎn)甲烷菌要求在氧化還原電位-330mV以下的環(huán)境生活，沼氣發(fā)酵要求在嚴(yán)格的厭氧環(huán)境中進(jìn)行。

沼氣發(fā)酵是指各種固態(tài)的有機(jī)廢物經(jīng)過(guò)沼氣微生物發(fā)酵產(chǎn)生沼氣的過(guò)程。一般可大致分為三個(gè)階段 ：

沼氣發(fā)酵液化階段

由于各種固體有機(jī)物通常不能進(jìn)入微生物體內(nèi)被微生物利用，因此必須在好氧和厭氧微生物分泌的胞外酶、表面酶（纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶）的作用下，將固體有機(jī)質(zhì)水解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的可溶性單糖、氨基酸、甘油、脂肪酸。這些相對(duì)分子質(zhì)量較小的可溶性物質(zhì)就可以進(jìn)入微生物細(xì)胞之內(nèi)被進(jìn)一步分解利用。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)酸階段

各種可溶性物質(zhì)（單糖、氨基酸、脂肪酸），在纖維素細(xì)菌、蛋白質(zhì)細(xì)菌、脂肪細(xì)菌、果膠細(xì)菌胞內(nèi)酶作用下繼續(xù)分解轉(zhuǎn)化成低分子物質(zhì)，如丁酸、丙酸、乙酸以及醇、酮、醛等簡(jiǎn)單有機(jī)物質(zhì)；同時(shí)也有部分氫、二氧化碳和氨等無(wú)機(jī)物的釋放。但在這個(gè)階段中，主要的產(chǎn)物是乙酸，約占70%以上，所以稱為產(chǎn)酸階段。參加這一階段的細(xì)菌稱為產(chǎn)酸菌。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)甲烷階段

由產(chǎn)甲烷菌將第二階段分解出的乙酸等簡(jiǎn)單有機(jī)物分解成甲烷和二氧化碳，其中二氧化碳在氫氣的作用下還原成甲烷。這一階段稱為產(chǎn)氣階段，或稱為產(chǎn)甲烷階段。

一般認(rèn)為，從各種復(fù)雜有機(jī)物的分解開始到最后生成沼氣，共有五大生理類群的細(xì)菌參與，它們是發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌。五群菌構(gòu)成一條食物鏈，根據(jù)其代謝產(chǎn)物的不同，前三群細(xì)菌共同完成水解酸化過(guò)程，后兩群細(xì)菌完成產(chǎn)甲烷過(guò)程。

沼氣發(fā)酵發(fā)酵性細(xì)菌

可用于沼氣發(fā)酵的有機(jī)物種類繁多，如禽畜糞便、作物秸稈、食物及酒精加工廢物等，其主要化學(xué)成分包括多糖類（如纖維素、半纖維素、淀粉、果膠質(zhì)等）、脂類和蛋白質(zhì)。這些復(fù)雜有機(jī)物大多不溶于水，必須首先被發(fā)酵性細(xì)菌所分泌的胞外酶分解為可溶性的糖、氨基酸和脂肪酸后，才能被微生物吸收利用。發(fā)酵性細(xì)菌將上述可溶性物質(zhì)吸收進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)發(fā)酵作用將其轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸和醇類，同時(shí)產(chǎn)生一定量的氫氣及二氧化碳。沼氣發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸的總量稱為總揮發(fā)酸（TVA）。在發(fā)酵正常的情況下，總發(fā)揮酸中以乙酸為主。蛋白類物質(zhì)分解時(shí)，除生成產(chǎn)物外，還會(huì)有氨額硫化氫產(chǎn)生。參與水解發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵性細(xì)菌種類繁多，已知的就有幾百種，包括梭狀芽孢桿菌、擬桿菌、丁酸菌、乳酸菌、雙歧桿菌和螺旋菌等。這些細(xì)菌多數(shù)為厭氧菌，也有兼性厭氧菌。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)甲烷菌

在沼氣發(fā)酵過(guò)程中，甲烷的形成是由一群高度專業(yè)化的細(xì)菌—產(chǎn)甲烷菌引起的。產(chǎn)甲烷菌包括食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌，它們是厭氧消化過(guò)程食物鏈中的最后一組成員，盡管它們具有各種各樣的形態(tài)，但它們?cè)谑澄镦溨械牡匚皇顾鼈兙哂泄餐纳硖匦浴Ｋ鼈冊(cè)趨捬鯒l件下將前三群細(xì)菌代謝的終產(chǎn)物，在沒有外源受氫體的情況下，把乙酸轉(zhuǎn)化為氣體產(chǎn)物甲烷和二氧化碳，使有機(jī)物在厭氧條件下的分解作用得以順利完成。 2100433B