底物化學(xué)發(fā)光

1. 印跡膜制備 按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，適當(dāng)?shù)姆忾]非常重要?？梢酝ㄟ^標(biāo)記一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交聯(lián)物。仔細(xì)地淋洗對于降低背景非常重要，在與HRP交聯(lián)物溫育后，膜片更需仔細(xì)洗滌，所有步驟均在室溫下完成。

2. 化學(xué)發(fā)光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。

3.蛋白信號顯現(xiàn)

1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。

2). 置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。

3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。

4). 于暗室中壓上x光片。

5).根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果。顯影沖洗。

6). 調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，再次曝光顯影。

4、膜的重復(fù)使用:

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫，最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉。

Chemiluminescent

非放射性發(fā)光系統(tǒng)，用于檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達(dá)1-5pg。用x光片可快速地獲得永久的硬拷貝結(jié)果。所含獨(dú)特的底物足以維持12小時(shí)以上的發(fā)光，便于反復(fù)曝光操作，免疫印跡膜經(jīng)抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。

2-8℃密封避光保存一年。

無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。如果不慎與眼、皮膚和衣物接觸，請立刻用大量清水沖洗。

辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物(luminol)氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中，將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)sds-page分離，并轉(zhuǎn)移到固相膜上(如nc、pvdf)等，用于免疫學(xué)檢測，經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接(標(biāo)記一抗)或間接(標(biāo)記二抗)反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經(jīng)x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

1. 試劑每個(gè)批號均獨(dú)立優(yōu)化，請不要混用或稀釋試劑以免降低敏感性;

2. 加入一抗后膜不能再干燥;

3. 適當(dāng)?shù)胤忾]和洗滌膜片至關(guān)重要;

4. 使用前配置化學(xué)發(fā)光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可，棄去使用過的混合試劑;

5. 使用干凈取樣頭取用每種試劑;

6. 第一張片子建議曝光1分鐘，觀察結(jié)果后判斷最佳曝光時(shí)間可從30秒至2小時(shí)不等;

7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外，所有步驟均不必在暗室中操作;

8. 膜片可經(jīng)適當(dāng)方法洗脫原有抗體，再次印跡使用，在此情況下，此試劑更為理想;

9. 因?yàn)樗幌笊镔|(zhì)需要從膜片上清除底物。

10. nan3能抑制HRP活性，應(yīng)避免使用nan3。