反相高效液相色譜簡介

反相高效液相色譜定義

反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當(dāng)今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。 反相色譜法適于分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務(wù)皆由反相色譜法完成。

反相高效液相色譜是化學(xué)鍵合相色譜法的一種?；瘜W(xué)鍵合相色譜法是由液液色譜法發(fā)展起來的，是為了解決在分離過程中，機械吸附在載體上的固體液的流失問題而發(fā)展出來的一種新方法。鍵合相色譜法通過將不同的有機官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵合到硅膠載體表面的游離烴基上，而生成化學(xué)鍵合固定相，化學(xué)鍵合固定相對各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，幾乎對各種類型的有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作，消除了分配色譜法的缺點。

根據(jù)鍵合固定相和流動相相對極性的強弱，可將鍵合色譜法分為正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法。反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜。在正相鍵合色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物。在反相鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動相的極性適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍也比正相鍵合相色譜法更廣泛。

反相高效液相色譜原理

在反相鍵合相色譜法中使用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔（或薄殼）微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理后與含輕基鏈(C4、C8、C18)或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。如共價結(jié)合到載體上的直鏈碳?xì)浠衔镎粱取ｊP(guān)于反相色譜的分離機理，吸附色譜的作用機制認(rèn)為溶質(zhì)在固定相上的保留主要是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。根據(jù)疏溶劑理論，當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動相后，即占據(jù)流動相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子。當(dāng)溶質(zhì)分子被流動相推動與固定相接觸時，溶質(zhì)分子的非極性部分或非極性因子會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，而直接與非極性固定相上的烷基官能團(tuán)相結(jié)合（吸附）形成締合絡(luò)合物，構(gòu)成單分子吸附層。這種疏溶劑的吸附作用是可逆的，當(dāng)流動相極性減少時，這種疏溶劑斥力下降，會發(fā)生解締，并將溶質(zhì)分子解放而被洗脫下來。

反相高效液相色譜影響溶質(zhì)保留值的三個因素

烷基鍵合固定相對每種溶質(zhì)分子締合作用和解締作用能力之差，就決定了溶質(zhì)分子在色譜過程的保留值。以下簡述影響溶質(zhì)保留值的三個因素:

1）溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)

在反相鍵合相色譜法中，溶質(zhì)的分離是以它們的疏水結(jié)構(gòu)差異為依據(jù)的，溶質(zhì)的極性越弱，疏水性也強，保留值越大。根據(jù)疏溶劑理論，溶質(zhì)的保留值與其分子中非極性部分的總表面積有關(guān)，其與烷基鍵合固定相結(jié)出的面積越大，保留值越大。

2) 烷基鍵合固定相的特性

烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性作用表面，因此鍵合到硅膠表面的烷基數(shù)量就決定著溶質(zhì)容量因子的大小。烷基的疏水特性隨碳鏈的加長而增加，溶質(zhì)的保留值也隨著烷基碳鏈長度的增加而增大。隨著烷基碳鏈的增長,增加了鍵合相的非極性作用的表面積，其不僅影響溶質(zhì)的保留值，還影響色譜柱的選擇性，即隨烷基碳鏈的加長其對溶質(zhì)分離的選擇性也增大。

3) 流動相性質(zhì)

流動相的表面張力愈大，介電常數(shù)愈大，其極性越強，此時溶質(zhì)與烷基鍵合相得締合能力越強，流動相的洗脫強度弱，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值越大。

反相高效液相色譜工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，反相高效液相色譜法獲得日益廣泛的應(yīng)用,在高效液相色譜法中也占有重要的地位。自冬梅等人提出了一種利用反相高效液相色譜法分析米根霉乳酸發(fā)酵液中有機酸的方法。應(yīng)用反相認(rèn)值kosil一11SC18RS色譜柱，以0.01mol/L磷酸(pH=2.5)作為流動相，發(fā)酵液經(jīng)稀硫酸預(yù)處理后直接進(jìn)樣分離定量，在10min內(nèi)把其中的乳酸、蘋果酸、富馬酸等完全分離定量，各種酸回收率大于97%。

其實驗結(jié)果證明，該方法能將米根霉乳酸發(fā)酵液中乳酸、蘋果酸和富馬酸完全分離并準(zhǔn)確定量。本方法具有前處理簡單、干擾小、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，對于及時測定乳酸發(fā)酵過程的變化具有重要意義，是測定乳酸發(fā)酵液中各有機酸的快速、有效的定量測定方法。

反相高效液相色譜藥代動力學(xué)中的應(yīng)用

高效液相色譜在藥物代謝動力學(xué)上的研究主要是為藥物代謝動力學(xué)軟件提供數(shù)據(jù)，并最終通過藥代動力學(xué)軟件處理得到藥物動力學(xué)結(jié)果。其中動力學(xué)參數(shù)主要集中在：吸收半衰期(tl/2。)、消除半衰期(t1126)、達(dá)峰時(tma)、最大血藥濃度(Cmax)、曲線下面積AUC、消除率CIB、表觀分布容積Vd等。通過這些動力學(xué)參數(shù)對藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行研究，并通過這種方法對藥物對機體的作用情況進(jìn)行比較，有利的指導(dǎo)藥物的開發(fā)和研制，在這個方向的研究可能是高效液相色譜與藥代動力學(xué)軟件聯(lián)用分析的發(fā)展方向。

反相器是可以將輸入信號的相位反轉(zhuǎn)180度，這種電路應(yīng)用在模擬電路，比如說音頻放大，時鐘振蕩器等。在電子線路設(shè)計中，經(jīng)常要用到反相器。隨著微電子技術(shù)與工藝的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，以計算機為代表的各類數(shù)字電子產(chǎn)品應(yīng)用越來越廣泛，與此同時也面臨著更加復(fù)雜的電磁環(huán)境。CMOS 反相器是幾乎所有數(shù)字集成電路設(shè)計的核心，它具有較大的噪聲容限、極高的輸入電阻、極低的靜態(tài)功耗以及對噪聲和干擾不敏感等優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用于數(shù)字集成電路中。HPM可以通過縫隙、孔洞以及外露連接線纜等“后門”途徑，耦合進(jìn)入電子系統(tǒng)內(nèi)部，影響系統(tǒng)內(nèi)器件的正常工作，CMOS 反相器作為構(gòu)成數(shù)字集成電路最基礎(chǔ)的功能單元和數(shù)字電子系統(tǒng)中最為典型的器件，極易受 HPM“后門”耦合作用的影響，進(jìn)而產(chǎn)生干擾、擾亂或直接損傷效應(yīng)。另外，CMOS 反相器有明確的邏輯功能，HPM 或者其它類型的強電磁脈沖對其產(chǎn)生的擾亂效應(yīng)相比于對其它器件來講更加明顯。因此，研究數(shù)字集成電路或者數(shù)字電子系統(tǒng)的 HPM 效應(yīng)，可以從 CMOS 反相器的HPM 效應(yīng)研究入手。已有研究指出 HPM 可以引起 CMOS 反相器的閂鎖(latch-up)效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致擾亂效應(yīng)，Kim等人對CMOS反相器的HPM效應(yīng)進(jìn)行了大量的實驗研究，得到了一些重要結(jié)論，比如，當(dāng)HPM頻率較高時其引發(fā)的CMOS反相器擾亂效應(yīng)將會被抑制等， CMOS 反相器在 HPM 作用下會發(fā)生閂鎖效應(yīng)并導(dǎo)致功能擾亂，但是一段時間后其功能可能會恢復(fù)正常，HPM 引起 CMOS 反相器閂鎖效應(yīng)的能量閾值特性。這些報道多數(shù)都是 HPM 效應(yīng)實驗的結(jié)果描述和規(guī)律統(tǒng)計，而針對具體效應(yīng)與規(guī)律進(jìn)行機理分析和微觀解釋的研究則相對較少。

CMOS 反相器憑借其互補結(jié)構(gòu)所具備的優(yōu)勢成為于數(shù)字電路設(shè)計中應(yīng)用最廣泛的一種器件。CMOS 反相器是由 n-MOSFET 與 p-MOSFET 組成的互補推拉式結(jié)構(gòu)，n-MOSFET 作為驅(qū)動管(下拉管)，p-MOSFET 作為負(fù)載管(上拉管）。包含 p-n-p-n 寄生結(jié)構(gòu)的 CMOS 基本結(jié)構(gòu)示意圖，兩個晶體管的柵極連接在一起，作為信號輸入端；兩個晶體管的襯底分別與它們的源極連接在一起，n-MOSFET 的源極接地 GND，p-MOSFET 的源極接電源電壓 Vdd；n-MOSFET 與 p-MOSFET 的漏極連接在一起作為反相器的輸出端。為了在集成電路中制造 n-MOSFET 和 p-MOSFET，必須形成絕緣的 p 襯底區(qū)和 n 襯底區(qū)，因此，CMOS 集成電路中具有 n 阱、p 阱和雙阱這三種工藝，本文針對 n 阱工藝下 CMOS 反相器進(jìn)行研究，即在重?fù)诫s的 p 型襯底硅上先生長一層輕摻雜 p 型外延層，然后通過 n 阱擴散工藝形成 n 阱，之后再制作場氧化層和柵氧化層，利用雜質(zhì)注入的方式形成源漏區(qū)和高摻雜擴散區(qū)，最后淀積和刻蝕出金屬化電極并對器件表面進(jìn)行一定程度的鈍化保護(hù)。這種情況下CMOS 結(jié)構(gòu)內(nèi)部會形成寄生的 n-p-n 雙極型晶體管 Q1 和 p-n-p 雙極型晶體管 Q2，Rsub和 Rwell代表 p 型襯底電阻和 n 阱電阻。在實際應(yīng)用時，CMOS 反相器電路可能還會包含諸如靜電放電(electrostatic discharge, ESD)保護(hù)電路、閂鎖防護(hù)電路以及輸入施密特整形電路等其它附屬電路。

關(guān)于 HPM 效應(yīng)的實驗主要有兩種方法，即輻照法和注入法。輻照法是指 HPM 以空間電磁波方式對目標(biāo)電子系統(tǒng)進(jìn)行輻照，得到的是電子系統(tǒng)的 HPM 效應(yīng)閾值。輻照法主要針對電子系統(tǒng)，能夠比較真實地模擬實際應(yīng)用環(huán)境中電子系統(tǒng)的 HPM 電磁輻射環(huán)境，是獲取電子系統(tǒng)整機 HPM 效應(yīng)閾值的最有效手段；但是這種方法也存在缺點，為了較為真實地模擬實際情況，實驗要求較高：微波波束需要覆蓋整個目標(biāo)電子系統(tǒng)，并且照射強度均勻，這就要求微波源輻射天線與效應(yīng)物之間的距離不能太小，但是通常實驗需要在特定的微波暗室中進(jìn)行，實驗空間有限，難以滿足輻照均勻的要求。另外，輻照實驗從 HPM 源到電子系統(tǒng)內(nèi)部元器件須經(jīng)過電磁傳輸和耦合等復(fù)雜過程，不利于對電子系統(tǒng) HPM 效應(yīng)機理進(jìn)行分析。注入法是指 HPM 以傳導(dǎo)方式注入目標(biāo)效應(yīng)物的敏感端口，觀測其瞬態(tài)響應(yīng)。注入法主要針對單元電路或器件，更適合于 HPM 效應(yīng)規(guī)律、效應(yīng)機理及敏感環(huán)節(jié)研究。注入法相對于輻照法更容易實現(xiàn)，對實驗環(huán)境的要求相對較低，可以在普通實驗室完成，主要需要解決兩個問題：一是減小注入通道的微波駐波系數(shù)，提高微波注入效率，使更多的微波功率進(jìn)入目標(biāo)電路或器件；二是要做好微波源和效應(yīng)目標(biāo)之間的隔離，避免相互影響和破壞，主要隔離措施有衰減、高通/低通濾波和隔離等。