共聚焦顯微技術(shù)

共聚焦顯微技術(shù)是在熒光顯 微分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，利用熒光顯微鏡可以對(duì)生物樣品發(fā)出的熒光進(jìn)行觀察和分析，但是熒光顯微鏡收集到的是樣品的整體熒光，來(lái)自樣品內(nèi)不同部位的 熒光信號(hào)相互干擾。難以區(qū)分，無(wú)法獲得準(zhǔn)確的定位和定量信息。 共聚焦顯微技術(shù)的出現(xiàn)很好地解決了這一問(wèn)題，這一技術(shù)可以獲取細(xì)胞內(nèi)某個(gè)薄層面上的熒光信息，而該層以外的信號(hào)被消除掉，成像清晰程度大大提高；結(jié)合計(jì)算 機(jī)自動(dòng)控制，可以對(duì)熒光信號(hào)的分布、強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行全方位的分析，得到豐富的信息。

與傳統(tǒng)顯微鏡相比共聚焦顯微鏡可抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像；具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片；增加側(cè)向分辨率；由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響。

共聚焦顯微鏡利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)

共聚焦原理

探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在 樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔內(nèi)，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛 的，因此被探測(cè)點(diǎn)即為共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即為共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃 描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器 上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面的連續(xù)光切圖像。

成像清晰

由于利用光學(xué)或數(shù)字技術(shù)消除了聚焦平面以外的熒光信號(hào)的干擾, 使我們要分析的區(qū)域內(nèi)的圖像清晰度提高, 得到更為準(zhǔn)確的定位和定量信息。

連續(xù)片層掃描及圖像重組

共聚焦顯微鏡在計(jì)算機(jī)的控制下可以對(duì)樣品中的不同層面進(jìn)行連續(xù)逐層掃描, 以獲得各個(gè)層面的圖像, 層面之間的間距可以達(dá)到0. 1微米甚至更小, 在圖像獲得后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)將這些圖形重組為三維圖像。與普通光學(xué)照相機(jī)獲得的圖像比較,共聚焦所得到的重組三維立體圖形清晰度高、層次分明、立體感更強(qiáng), 通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件處理, 可以對(duì)三維圖形進(jìn)行任何形式的旋轉(zhuǎn), 可以從任何角度進(jìn)行觀察, 還可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)選定結(jié)構(gòu)進(jìn)行長(zhǎng)度、體積的測(cè)量和計(jì)算, 在分析細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)和某些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的精確定位方面具有明顯的優(yōu)勢(shì), 這也是共聚焦顯微技術(shù)諸多功能中應(yīng)用最廣泛的一種。

多標(biāo)記技術(shù)

利用共聚焦系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)利用兩種或三種不同的熒光染料分別標(biāo)記了細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)(如分別標(biāo)記染色體和細(xì)胞骨架系 統(tǒng)) 的樣品進(jìn)行觀察, 這樣一次實(shí)驗(yàn)觀察就可以獲得細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的信息, 對(duì)不同結(jié)構(gòu)組分的定位、相互聯(lián)系方式進(jìn)行研究。在最終獲得的圖像可以分開(kāi)表示單個(gè)結(jié)構(gòu); 也可以將圖片迭加在一起, 用不同顏色表示不同的結(jié)構(gòu), 更加直觀, 這是普通熒光顯微鏡無(wú)法做到的。

活體觀察

除了可以對(duì)固定標(biāo)本的細(xì)胞進(jìn)行觀察外, 共聚焦顯微技術(shù)還可以在不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定或其他損傷性處理的情況下進(jìn)行觀察, 獲得活細(xì)胞內(nèi)[5]的信息, 顯示在活體情況下細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)結(jié)構(gòu)和生理學(xué)特征。更為重要的是利用共聚焦顯微鏡可以跟蹤自然狀態(tài)下或受某種因素刺激后活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程隨時(shí)間變化的情況, 得到準(zhǔn)確而直觀的動(dòng)態(tài)變化資料, 為分析細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)提供直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

獲得數(shù)量化信息

共聚焦顯微技術(shù)不僅能夠?qū)?xì)胞內(nèi)熒光進(jìn)行定位, 還可以對(duì)其進(jìn)行定量分析, 獲得二維或三維空間內(nèi)分布在樣品不同部位的熒光強(qiáng)度數(shù)值以及熒光強(qiáng)度在各種處理?xiàng)l件下的變化情況。量化信息的獲得是研究活細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)時(shí)重要的手 段, 而共聚焦顯微技術(shù)在這一方面的優(yōu)勢(shì)是其他技術(shù)所無(wú)法達(dá)到的。

共聚焦顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍包括形態(tài)學(xué)觀察與測(cè)量、生物學(xué)測(cè)量蛋白質(zhì)功能檢測(cè)與包括在光譜測(cè)量中的其它方面的應(yīng)用。

其中該技術(shù)在形態(tài)學(xué)的觀察與測(cè)量方面包括亞細(xì)胞器定位，如最簡(jiǎn)單的二維定位、定量及三維定位、圖像重組等。

生物學(xué)測(cè)量方面可以分為動(dòng)態(tài)與靜態(tài)的生物學(xué)測(cè)量，在動(dòng)態(tài)與靜態(tài)水平都可以同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化(Mg2+ 、Na+ 、K+等)、自由基的動(dòng)靜態(tài)水平、線粒體膜電位的動(dòng)靜態(tài)變化及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位（不過(guò)靜態(tài)測(cè)量時(shí)需用固定樣品）。此外，動(dòng)態(tài)測(cè)量還可以對(duì)藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行定位分布及定量。

蛋白質(zhì)功能檢測(cè)[6]可分為蛋白熒光恢復(fù)的測(cè)量(FRAP)與FLIP、籠索解籠索的測(cè)量與動(dòng)態(tài)/靜態(tài)兼可的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)三種測(cè)量方式。