高效液相色譜柱故障排除

1、柱壓過(guò)高

可能是微粒堵塞． 柱床膨脹，不可逆吸附， 細(xì)菌生長(zhǎng)等造成的。也有可能是系統(tǒng)反壓?jiǎn)栴}， 例如阻尼器堵塞，進(jìn)樣器堵塞， 管路或連接口堵塞。 在線過(guò)濾器不干凈， 壓力傳感器不準(zhǔn)確等。

2、柱效低

可能是色譜柱被污染、 過(guò)濾片部分堵塞、色譜柱內(nèi)的死體積造成，例如流動(dòng)相pH值或者組成不合適造成固定相損失。 流動(dòng)相急劇變化造成固定相物理?yè)p壞， 機(jī)械振動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫，柱床收縮或干枯。也有可能是儀器連接的問(wèn)題， 認(rèn)真檢查進(jìn)樣器、檢測(cè)器、 管路、 保護(hù)柱和在線過(guò)濾器等是否連接好，也可能是色譜柱沒(méi)有平衡好， 進(jìn)樣量過(guò)大等問(wèn)題。

3、重復(fù)性差、不出峰、回收率低

可能是色譜柱被污染， 流動(dòng)相 pH值或者組成不合適造成固定相損失 ， 樣 品溶劑 不同或樣品本身不穩(wěn)定， 固定 相極性過(guò)強(qiáng)或者流動(dòng)相極性過(guò)弱． 或者發(fā)生非特異性吸附。也可能梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足，溫度波動(dòng)， 流動(dòng)相組成改變， 樣品溶劑不同， 樣品穩(wěn)定性不好，方法的開(kāi)發(fā)不好， 緩沖液的酸堿度不合適或者緩沖能力不足。2100433B

高效液相色譜柱柱效和保護(hù)柱

拿到一根新柱時(shí)，一定要先看其使說(shuō)明，然后測(cè)柱效，定期檢測(cè)柱效， 保留在新色譜柱上得到的色譜圖，并記錄條件， 定期檢測(cè)儀器的譜帶展寬。 若應(yīng)用于在線監(jiān)測(cè)， 應(yīng)對(duì)色譜柱提供在線的物理保護(hù)和化學(xué)保護(hù)， 例如采取安裝在線過(guò)濾器， 自裝填料保護(hù)柱和預(yù)裝保護(hù)柱等。在線過(guò)濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計(jì)，優(yōu)點(diǎn)是基本不影響柱效， 在需要高柱效的時(shí)候常用， 常更換的消耗品是濾芯和墊圈保護(hù)柱的作用是防止柱子被化學(xué)污染。缺點(diǎn)是多數(shù)保護(hù)柱影響色譜柱的柱效， 特別是在用微柱時(shí)，常用的是普通 自裝填料的保護(hù)柱。最近新出的一些保護(hù)柱例如Sentry—guard保護(hù)柱， 它的特點(diǎn)是高質(zhì)量、高效填料、 增加分析柱效、對(duì)臟樣品載荷能力大 ，能延長(zhǎng)保護(hù)柱的壽命，手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具，省時(shí)省，可換芯式設(shè)計(jì)，能采用各種不同的填料，主要適用于非常臟非常復(fù)雜的樣品本底，例如生化樣品，環(huán)境樣品和食品等，或者不想做太多的圃相萃取，不想降低柱效果等情況。

高效液相色譜柱清洗

對(duì)所做的樣品要有充分的了解，用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗，對(duì)于硅膠柱，先用甲醇洗去極性雜質(zhì)，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 100 — 20OraL依次活化，對(duì)于鍵和相柱，一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次沖洗，每種色譜柱有特定的清洗方法，一定要看其使用說(shuō)明。

高效液相色譜柱存放

存放前除去雜質(zhì)和鹽，采用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的干枯，避免機(jī)械振動(dòng)，防止細(xì)菌生長(zhǎng)，注意存放的溫度。

高效液相色譜柱填充劑的要求

最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對(duì)映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果?？讖皆?5nm（1nm=10?）以下的填料適合于分析分子量小于2000 的化合物，分子量大于2000 的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm 以上的填料。除另有規(guī)定外，分析柱的填充劑粒徑一般在3μm~10μm 之間。粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm），使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種正文規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。

高效液相色譜柱溫度的要求

以硅膠為載體的普通鍵合固定相的使用溫度通常不超過(guò)35℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不能超過(guò)60℃。

高效液相色譜柱流動(dòng)相的要求

流動(dòng)相的pH 值應(yīng)控制在2～8 之間。當(dāng)pH 值大于8 時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH 值小于2 時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH 值大于8 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用pH 值小于2 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑等。

液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：

a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸內(nèi)螺紋，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋（國(guó)內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英寸內(nèi)螺紋與1/4英寸柱管（Φ6.35mm）連接，中間放置壓環(huán)用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸（Φ1.57mm）的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用Φ1.57mm連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長(zhǎng)或其他固定尺寸）。

在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或?yàn)V網(wǎng)），用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316L不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

b、柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。

正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH₂等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)（ODS）的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。