化學(xué)發(fā)光劑常用發(fā)光劑

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。HRP的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物和對-羥基苯乙酸。AP的發(fā)光底物為3-(2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)和4-甲基傘形酮磷酸鹽(4-MUP，熒光底物)。

(1).魯米諾或其衍生物。 魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris緩沖液作底物液。要注意是:首先,魯米諾和H2O2在無HRP催化時(shí)也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強(qiáng)度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP發(fā)光增強(qiáng)劑如某些酚試劑(如鄰-碘酚)或螢火蟲熒光素酶可增強(qiáng)HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)和延長發(fā)光時(shí)間，提高發(fā)光敏感度。

(2).對-羥基苯乙酸(HPA)。 對-羥基苯乙酸(HPA)在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚體(熒光物質(zhì))，在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計(jì)測量。

(3).AMPPD。 AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15-60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對穩(wěn)定。

(4)4-MUP。 4-MUP被ALP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，用熒光光度計(jì)進(jìn)行測量。

直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)，如吖啶酯(acridinium, AE)在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。

電化學(xué)發(fā)光劑

電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+(圖16-7)和電子供體三丙胺(TPA)在陽性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，成為強(qiáng)氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子(H+)，形成自由基TPA.，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。

一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光 (luminescence)。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能可將發(fā)光分為三種類型:光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。

用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[ Ru(bpy)3]標(biāo)記抗體，通過抗原抗體反應(yīng)和磁顆粒分離技術(shù)，根據(jù) 三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度的大小對待測抗原或抗體進(jìn)行定性或定量分析。