酶標(biāo)抗體制備技術(shù)

用抗HRP McAb制備PAP復(fù)合物的工藝條件較為簡便，而且不需嚴(yán)格的條件限制。用小鼠抗HRP McAb制備的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反應(yīng)2h，即成鼠PAP復(fù)合物。以按HRP/IgG克分子比為4︰1制備為宜。

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)，系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，由多個(gè)同功酶組成。從小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kDa，酶作用的最適pH為9.6;從大腸桿菌中提取酶分子量為80kDa，最適pH為8.0。它的作用底物較多，常用的酶底物有對硝基本磷酸鹽(PNP)、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。AP主要用作雙標(biāo)記染色，研究遞質(zhì)共存及酶免疫測定。AP標(biāo)記抗體，一般采用戊二醛作交聯(lián)劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個(gè)醛基結(jié)合。

(1)取抗體(2~5mg/mL)1mL，加入AP 5mg溶解。

(2)裝入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，換液3次。

(3)加入2.5%戊二醛20uL，室溫(20℃±)放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析過夜，換液3次。

(4)移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液中，4℃透析過夜，換液3次。

(5)取出標(biāo)記抗體，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl緩沖液稀釋至4mL，即為酶標(biāo)記物原液。

(6)加入1/3量純甘油，測定工作效價(jià)后，小量(0.1mL)分裝，4℃保存(使用前以pH7.4PBS-吐溫溶液將結(jié)合物適當(dāng)稀釋)。

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由無色酶蛋白和深棕色鐵卟啉(輔基)構(gòu)成一種糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。

HRP分子量較小(40kDa)，標(biāo)記物容易穿透入細(xì)胞內(nèi)部;作用底物為H2O2，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為供氫體的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察;在pH3.5~12范圍內(nèi)穩(wěn)定，對熱及有機(jī)溶劑的作用亦較穩(wěn)定，能耐受63℃加熱15min;用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性;溶解性好，100mL緩沖鹽溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級沉淀法分離純化;氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對HRP的活性有抑制作用，應(yīng)避免使用NaN3作為酶標(biāo)試劑的防腐劑，以防止失活。

凡能在HRP和H2O2存在時(shí)被酶催化H2O2反應(yīng)而和成有色產(chǎn)物的化合物(供氫體)都可以用顯色劑。供氫體的產(chǎn)物分不溶性和可溶性兩類。前者最常用的為3，3'二氨基聯(lián)苯胺(3,3'diaminobenzidine,DAB)，適用于免疫組化法;反應(yīng)后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產(chǎn)物，適用電鏡檢查;此外還有飽和聯(lián)苯胺溶液，氧化后產(chǎn)物呈黃褐色，多用于酶免疫擴(kuò)散的深沉線顯色。后者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，產(chǎn)物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm，可用肉眼判別;易被濃酸終止反應(yīng)，顏色可數(shù)小時(shí)不變，是ELISA中最常用的一種;但對光敏感，使用時(shí)要避光，并發(fā)現(xiàn)有致癌作用。

用HRP標(biāo)記抗體需借助交聯(lián)劑的作用，將酶連接在抗體分子上。常用的交聯(lián)劑為過碘酸鈉和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。

HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉(NaHB4)還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。

[標(biāo)記步驟]

(1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)無水乙醇溶液0.1mL，室溫(20℃±)下輕微攪拌作用1h。

(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色。

(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室溫(20℃±)下輕攪作用1 h，終止氧化反應(yīng)。

(4)加入5mg抗體(Ig)，裝入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液(無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g,蒸餾水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析過夜，更換3次。

(5)取出透析袋中液體(約3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或過夜。

(6)加50%飽和硫酸銨(NH4)2SO4溶液(硫酸銨850g，蒸餾水加至1 000 mL，以30%氨水調(diào)pH7.2)6 mL沉淀結(jié)合物，置4℃30min后，3 000r/min離心30min，取深沉(SPA不需要進(jìn)行此步)。

(7)將沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h，換液3次。

(8)在結(jié)合物內(nèi)加入BSA至蛋白濃度為10mg/ mL，或加等量60%甘油，測定工作效價(jià)后，小量分裝(或凍干，不需加甘油)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，通過它的兩個(gè)醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結(jié)合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結(jié)合物。反應(yīng)可在4-40℃溫度范圍，pH6.0~8.0 的緩沖溶液中進(jìn)行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標(biāo)記抗體混合，同時(shí)加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結(jié)合物，結(jié)過透析或?qū)游龀ノ唇Y(jié)合的戊二醛，然后再與抗體結(jié)合。

[標(biāo)記步驟]

(1)取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB將25%戊二醛稀釋為1.25%)，室溫(20℃左右)反應(yīng)結(jié)合18h。

(2)用0.15mol/LNaCl平衡過的Sephadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析過夜。

(3)將5mg抗體IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再與醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。

(4)加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)pH至9.0~9.6)，4℃，電磁攪拌下結(jié)合24h。

(5)加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸(0.29g溶于10mL蒸餾水)，4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應(yīng)。

(6)裝入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析過夜，或通過Sephadex G-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液，加入等量60%甘油，測工作效價(jià)后，小量分裝，4℃或-20℃保存。

抗過氧化物復(fù)合物制備技術(shù)

Stemberger(1970)等，首先報(bào)道了過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP)法，此法也稱為非標(biāo)記抗體酶法(unlabelled antibody enzymemethod)。PAP法不需用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，二者活性不受化學(xué)反應(yīng)的影響，可大大提高免疫酶法的靈敏度。

(1)取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃離心20min，取上清液。

(2)加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混勻，室溫(20℃±)靜置1h，16 000r/min，4℃離心20min，取沉淀物。

(3)加冷生理鹽水反復(fù)洗滌-離心(16 000r/min，4℃離心20min)3次，棄上清，取沉淀物。

(4)加入過量HRP溶液4mL(2mg/mL)混勻后，移至小燒杯內(nèi)。

(5)在pH計(jì)監(jiān)控下，邊攪拌邊加入0.1及0.01mol/L HCl調(diào)至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。

(6)立即加入0.01mol/LnaOH,調(diào)pH7.4，16 000r/min，4℃離心20min，取上清液。

(7)加入1/10體積的0.075mol/L醋酸鈉和0.15mol/L醋酸銨的等量混合液后混勻。

(8)電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，并繼續(xù)攪拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃離心20min，去上清，取深沉物。

(9)以50%飽和硫酸銨洗滌，4℃、16 000r/min×20min，離心2次，取深沉物。

(10)加5mL蒸餾水將深沉物溶解后裝入透析袋，用Ph6.75醋酸鹽緩沖液(13.5L生理鹽水、1.5L蒸餾水、75mL 1.5mol/L醋酸鈉及75mL粉酶3moL/L醋酸銨)4℃透析3d，每天換液2次。

(11)17 000r/min，4℃離心20min，取上清液進(jìn)行工作效價(jià)鑒定。

(12)加等量60%甘油，小量分裝，-20℃保存。

-抗堿性磷酸酶復(fù)合物制備技術(shù)

Mason等(1978)，用堿性磷酸酶代替過氧化物酶，建立了堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物(APAAP)橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)。但以AP作為抗原用常規(guī)免疫方法制備的抗血清，很難達(dá)到APAPP橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)的質(zhì)量要求，在一定程度上限制了此項(xiàng)技術(shù)的推廣使用。楊志剛等(1989)利用抗AP的McAb建立了一種制備APAAP復(fù)合物的簡便方法。只需將AP和抗AP的McAb以適當(dāng)比例混合，4℃結(jié)合過夜即可使用。采用改良的ELISA方法檢測APAAP復(fù)合中AP的最適含量。具體方法是:用羊抗鼠Ig包被微量滴定板;加入一定量的抗APMcAb;分別加入不同量的AP作用后經(jīng)過洗滌;加底物顯色，測定光密度值(OD)。在一定范圍內(nèi)，APAAP復(fù)合物溶液中AP含量增加的同時(shí)，相應(yīng)的OD值也隨之增大;當(dāng)AP增加到一定量時(shí)(約6~8mg/mL)、OD值保持穩(wěn)定。

每孔清洗液殘留量<1μl

具備微孔板底部清洗功能，震蕩與浸泡功能

開關(guān)機(jī)自動蒸餾水沖洗，專有過濾有效避免管路堵塞

可自定義洗板過程中自動沖洗管路的時(shí)間和板數(shù)間隔

專利洗頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，96孔間加液誤差CV<1.5%

標(biāo)本量任意，可進(jìn)行跨行清洗，不足一排無需補(bǔ)孔

三種洗液可選切換方便，液量自動監(jiān)測并自動報(bào)警提示

專利酶標(biāo)托盤底面斜面設(shè)計(jì)，廢液自動收集免清潔

50個(gè)用戶洗板程序自動存儲功能，每個(gè)程序獨(dú)立貯存一種板型位置

AT-858自動酶標(biāo)分析儀

產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn) (2000)B401050/B《AT型自動酶標(biāo)分析儀》Q/CYBX02-2002

還有一種需要純化抗體的試驗(yàn)，是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有復(fù)雜多樣的抗體，它不僅含有針對免疫原產(chǎn)生的抗體，還有血清的全部抗體。出于特定目的的需要，必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時(shí)，需要分離出特異性識別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術(shù)中，使用純化抗體都能降低非特異性本底。產(chǎn)生這種效果主要是因?yàn)橐环矫婺苋コ饘?shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白，另一方面能精確控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號的抗體量。使用純化抗體不會使本底增加，因此純化抗體可以作為所有免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中降低本底的基本手段。

抗體的純化通常是濃縮抗體的最簡單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。

盡管純化抗體的方法較多，建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為最常用的方法。這種方法效率高，能為常用的實(shí)驗(yàn)方法提供足夠純化的抗體，而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質(zhì)的出現(xiàn)，能將任何來源的抗體純化?？贵w的純化也可采用傳統(tǒng)的色譜法，在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡單，并且純化效果是其他方法的數(shù)倍。