脈沖場凝膠電泳

1.以TE緩沖液懸浮λ多聯(lián)體(Boehringer MA寶靈曼公司產品)，濃度為4μg/40μl。

2.用等體積TE配制的2%低熔點瓊脂糖(溫度保持在45℃)混勻。

3.移去混合液注入預冷的凝膠塊模具中。

4.室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天。

1.從YPD(酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖)培養(yǎng)基瓶皿中挑選單一克隆加入10ml

YPD預培養(yǎng)的肉湯中，30℃下劇烈震蕩生長24小時，然后加入200ml YPD肉湯，劇烈振蕩24~48h(產量大約100塊)。

2.4000×g轉速，離心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。

3.仍以4000×g轉速離心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸鈉，pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重懸。

4.取稀釋后的細胞懸液用Neubauer腔計數(shù)。

5.溶液短暫離心后，再用SCE重懸細胞，使40μl SCE溶液中含5×107個細胞(相當于80μl體積的模塊中含有5×107個細胞)。

6.溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15~30min。

7.細胞懸液與等體積的SCE配制的2%低熔點瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。

8.將混合物移注入預冷的凝膠塊模具中。

9.凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1~2小時。

10. 將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃溫育48h。

11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次，每次20min。

12. 凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。

1.將0.8%的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化后冷卻至50~60℃，立即注入凝膠框架中，并插入梳子。

2.凝膠固化后小心地拔出齒梳，用2把無菌手術刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時應將手術刀片燒灼后冷卻。將DNA大小標志物上樣至凝膠的兩旁。

3.用1%液態(tài)低熔點瓊脂糖凝膠(0.25×TBE配制)密封狹槽。

4.若有氣泡存在，用注射器驅趕氣泡。

5.一旦密封的低熔點瓊脂糖已固化(大約10min)，可將凝膠擱入腔室，并用電泳緩沖液覆蓋過膠面。

6.應設定合適的電壓及轉換時間(參考《分子醫(yī)學技術》84頁表8.1)并開始電泳。兩個不同電泳方向的電流應相等。

7.電泳結束后，凝膠用0.25×TBE配制成的EB(0.4μg/ml)染色。

8.用泵自槽中排除緩沖液，續(xù)以雙蒸水沖洗電泳槽。

9.凝膠成像:DNA在曝光的過程中可能會形成缺口。

10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝膠30min，讓DNA脫嘌呤，并有利于轉移。

11. 凝膠用堿(變性溶液中)變性20min，兩次，續(xù)以中性溶液1~5min。

12. 采用標準Southern印跡方案將DNA轉印至尼龍膜上。一般來說，印跡PFGE凝膠的時間較普通凝膠印跡時間長(約48h)。

1.收集10ml全血，加入30ml細胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細胞完全溶解。

2.2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細胞裂解液洗滌細胞，然后用PBS重懸細胞。

3.稀釋單細胞懸液并取一小份用Neubauer腔計數(shù)細胞。

4.用PBS重懸細胞，以達到40μl PBS中含1百萬個細胞比例(1百萬個二倍體哺乳動物大約含有基因組DNA 10μg)

5.用PBS配制2%濃度低熔點瓊脂糖溶液并保持在50℃。

6.將等體積(各1ml)細胞懸液與瓊脂糖溶液于室溫下混勻，立即倒入凝膠塊模具中。

7.靜置20min讓瓊脂糖固化，用無菌塑料杯(通常用作劃菌)將凝膠塊自模具中取出并置入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8.將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩沖液于50℃保持2~3天。每個盛有50ml蛋白酶緩沖液的Falcon管可容納多達100個凝膠塊。

9.蛋白酶K消化后，可將凝膠塊保留在此緩沖液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10. 此外，繼續(xù)將凝膠塊用高壓消毒過的TE緩沖液沖洗數(shù)遍的步驟。

11. 將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶K。

12. 室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數(shù)次，將凝膠塊放入另一干凈的試管，可直接用于酶切反應或用0.5mol/L

EDTA，(pH8.0)4℃保存凝膠塊。

13. 若用EDTA保存凝膠塊，取出后應用TE溶液室溫下漂洗30 min×2次。

1.應使用消毒溶液及戴無菌手套以免DNA降解。

2.在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min 3次，以去除EDTA。

3.混合:酶反應緩沖液(高、中或低鹽緩沖液)，100

mmol/L亞精胺(只用于高鹽緩沖液狀態(tài))，10~20單位的內切酶。20單位的內切酶就足以過夜完全消化10μg DNA。

4.設立一個除內切酶成分外含有混合物各組分的陰性對照，以檢查是否有非特異性DNA降解。

5.將瓊脂糖凝膠塊加入反應混合溶液中:通常用消毒過的手術刀或套環(huán)將凝膠塊移入。

6.若兩種內切酶所需緩沖液條件一致，可以同時或先后用兩種不同的酶進行消化(先用低鹽緩沖液的酶消化，再調整鹽濃度)。倘若首次消化的酶要求50℃條件，在第二個酶消化時要換緩沖液。

7.若要進行部分消化，則首先在同一溫度和反應時間用1:10稀釋的酶進行嘗試。