脈沖場凝膠電泳制備加工

1.收集10ml全血，加入30ml細(xì)胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細(xì)胞完全溶解。

2.2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細(xì)胞裂解液洗滌細(xì)胞，然后用PBS重懸細(xì)胞。

3.稀釋單細(xì)胞懸液并取一小份用Neubauer腔計(jì)數(shù)細(xì)胞。

4.用PBS重懸細(xì)胞，以達(dá)到40μl PBS中含1百萬個(gè)細(xì)胞比例(1百萬個(gè)二倍體哺乳動(dòng)物大約含有基因組DNA 10μg)

5.用PBS配制2%濃度低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液并保持在50℃。

6.將等體積(各1ml)細(xì)胞懸液與瓊脂糖溶液于室溫下混勻，立即倒入凝膠塊模具中。

7.靜置20min讓瓊脂糖固化，用無菌塑料杯(通常用作劃菌)將凝膠塊自模具中取出并置入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8.將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩沖液于50℃保持2~3天。每個(gè)盛有50ml蛋白酶緩沖液的Falcon管可容納多達(dá)100個(gè)凝膠塊。

9.蛋白酶K消化后，可將凝膠塊保留在此緩沖液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10. 此外，繼續(xù)將凝膠塊用高壓消毒過的TE緩沖液沖洗數(shù)遍的步驟。

11. 將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶K。

12. 室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數(shù)次，將凝膠塊放入另一干凈的試管，可直接用于酶切反應(yīng)或用0.5mol/L

EDTA，(pH8.0)4℃保存凝膠塊。

13. 若用EDTA保存凝膠塊，取出后應(yīng)用TE溶液室溫下漂洗30 min×2次。

1.以TE緩沖液懸浮λ多聯(lián)體(Boehringer MA寶靈曼公司產(chǎn)品)，濃度為4μg/40μl。

2.用等體積TE配制的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖(溫度保持在45℃)混勻。

3.移去混合液注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。

4.室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天。

1.從YPD(酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖)培養(yǎng)基瓶皿中挑選單一克隆加入10ml

YPD預(yù)培養(yǎng)的肉湯中，30℃下劇烈震蕩生長24小時(shí)，然后加入200ml YPD肉湯，劇烈振蕩24~48h(產(chǎn)量大約100塊)。

2.4000×g轉(zhuǎn)速，離心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。

3.仍以4000×g轉(zhuǎn)速離心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸鈉，pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重懸。

4.取稀釋后的細(xì)胞懸液用Neubauer腔計(jì)數(shù)。

5.溶液短暫離心后，再用SCE重懸細(xì)胞，使40μl SCE溶液中含5×107個(gè)細(xì)胞(相當(dāng)于80μl體積的模塊中含有5×107個(gè)細(xì)胞)。

6.溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15~30min。

7.細(xì)胞懸液與等體積的SCE配制的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。

8.將混合物移注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。

9.凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1~2小時(shí)。

10. 將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃溫育48h。

11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次，每次20min。

12. 凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。

1.應(yīng)使用消毒溶液及戴無菌手套以免DNA降解。

2.在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min 3次，以去除EDTA。

3.混合:酶反應(yīng)緩沖液(高、中或低鹽緩沖液)，100

mmol/L亞精胺(只用于高鹽緩沖液狀態(tài))，10~20單位的內(nèi)切酶。20單位的內(nèi)切酶就足以過夜完全消化10μg DNA。

4.設(shè)立一個(gè)除內(nèi)切酶成分外含有混合物各組分的陰性對照，以檢查是否有非特異性DNA降解。

5.將瓊脂糖凝膠塊加入反應(yīng)混合溶液中:通常用消毒過的手術(shù)刀或套環(huán)將凝膠塊移入。

6.若兩種內(nèi)切酶所需緩沖液條件一致，可以同時(shí)或先后用兩種不同的酶進(jìn)行消化(先用低鹽緩沖液的酶消化，再調(diào)整鹽濃度)。倘若首次消化的酶要求50℃條件，在第二個(gè)酶消化時(shí)要換緩沖液。

7.若要進(jìn)行部分消化，則首先在同一溫度和反應(yīng)時(shí)間用1:10稀釋的酶進(jìn)行嘗試。

1.將0.8%的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化后冷卻至50~60℃，立即注入凝膠框架中，并插入梳子。

2.凝膠固化后小心地拔出齒梳，用2把無菌手術(shù)刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內(nèi)切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時(shí)應(yīng)將手術(shù)刀片燒灼后冷卻。將DNA大小標(biāo)志物上樣至凝膠的兩旁。

3.用1%液態(tài)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(0.25×TBE配制)密封狹槽。

4.若有氣泡存在，用注射器驅(qū)趕氣泡。

5.一旦密封的低熔點(diǎn)瓊脂糖已固化(大約10min)，可將凝膠擱入腔室，并用電泳緩沖液覆蓋過膠面。

6.應(yīng)設(shè)定合適的電壓及轉(zhuǎn)換時(shí)間(參考《分子醫(yī)學(xué)技術(shù)》84頁表8.1)并開始電泳。兩個(gè)不同電泳方向的電流應(yīng)相等。

7.電泳結(jié)束后，凝膠用0.25×TBE配制成的EB(0.4μg/ml)染色。

8.用泵自槽中排除緩沖液，續(xù)以雙蒸水沖洗電泳槽。

9.凝膠成像:DNA在曝光的過程中可能會(huì)形成缺口。

10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝膠30min，讓DNA脫嘌呤，并有利于轉(zhuǎn)移。

11. 凝膠用堿(變性溶液中)變性20min，兩次，續(xù)以中性溶液1~5min。

12. 采用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方案將DNA轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。一般來說，印跡PFGE凝膠的時(shí)間較普通凝膠印跡時(shí)間長(約48h)。