雙向凝膠電泳

1、建議使用的蛋白質(zhì)溶解體系為8M尿素/4%CHAPS /40mMTris(Base)/65mM DTT;

2、樣品濃度大于2 μg/ μl;

雙向電泳成功的關(guān)鍵在于建立一套有效的、可重復(fù)的樣品制備方法。樣品制備的影響因素包括蛋白質(zhì)的溶解性、分子量、電荷數(shù)及等電點等。對于不同的樣品性質(zhì)及研究目的，其方法也不盡相同。不同的樣品性質(zhì)， 用于樣品處理的緩沖液必須在低離子強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，既能保持蛋白質(zhì)的天然電荷。又能維持其溶解性。因此，絕大多數(shù)樣品往往都需要通過多次實驗才能摸索到最適宜的條件。

等電聚焦

蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同的pH環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。對每個蛋白質(zhì)來說都有一個特定的pH，此時蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并且隨著移動的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。聚焦是一個與pH相關(guān)的平衡過程:蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI值;在等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)可以從各個方向移動到它的恒定位點。

SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳

雙向電泳的第二向是將IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向SDS.PAGE凝膠上，根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量或分子量(MW)大小與第一相垂直的分離。

蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì).SDS復(fù)合物，由于SDS是一種強(qiáng)陰離子去垢劑.所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響.而主要取決于蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量大小，其遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，在蛋白質(zhì)組研究中。需要在同樣的條件下同時走多塊膠，這對凝膠與凝膠之間的比較十分重要。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及目前發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質(zhì)的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發(fā)生有關(guān)。用雙向凝膠電泳可以進(jìn)行翻譯后修飾的研究，如用32P標(biāo)記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中常可發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)拖曳現(xiàn)象，很可能是一個蛋白的不同翻譯后修飾產(chǎn)物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能提供重要的信息。

(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調(diào)節(jié)蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜用到PVDF膜上，但當(dāng)前的技術(shù)還不足以檢出拷貝數(shù)低于1000的蛋白質(zhì)。

(2)極酸或極堿蛋白的分離。

(3)極大(>200kD)或極小(<10kD=蛋白的分離)。

(4)難溶蛋白的檢測，這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白。

(5)得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)，因此迫切需要自動二維電泳儀的出現(xiàn)。

1、根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(第一向)和分子量(第二向)的不同進(jìn)行分離。

2、電泳后根據(jù)蛋白質(zhì)的上樣量對膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色，然后用相關(guān)軟件對電泳圖象進(jìn)行分析。

凝膠染色的目的是使其中的蛋白質(zhì)能夠被觀察到。目前還沒有通用的染色方法，只能在考慮多種因素如需要的靈敏度、線性范圍、方便程度、費用、以及成像設(shè)備類型等基礎(chǔ)上，結(jié)合實際進(jìn)行選擇。有時也可以將蛋白轉(zhuǎn)膜后通過免疫印跡的方法來進(jìn)行檢測。

成像設(shè)備可以攝人圖像，對凝膠圖像以數(shù)字形式保存，對每塊凝膠圖像進(jìn)行平等的比較，在各研究組之間傳遞信息，并對大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類分析。目前應(yīng)用較為廣泛的圖像分析軟件有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator等，分辨率較高，功能齊全。盡管如此，仍不可避免約10%的未檢出點和假點，需要手工添加、刪除和分割。圖像采集完成后?？梢詰?yīng)用各種分析軟件進(jìn)行分析，可以收集、詮釋、比較蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)資料等。

一旦通過差異分析或其它方法找到感興趣的蛋白后.就可以從凝膠中或膜上切取這些目標(biāo)蛋白質(zhì)作鑒定?，F(xiàn)在絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的鑒定是通過質(zhì)譜分析來完成的。

分離蛋白質(zhì)組所有蛋白的兩個關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復(fù)性。在目前情況下，雙向凝膠電泳的一塊膠板(16cm×20cm)可分出3~4千個，甚至1萬個可檢測的蛋白斑點，這與10萬個基因可表達(dá)的蛋白數(shù)目相比還是太少了。80年代開始采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范圍(如0.05U/cm)，對特別感興趣的區(qū)域可在較窄的pH范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率。此種膠條已有商品生產(chǎn)，因此基本上解決了雙向凝膠電泳重復(fù)性的問題。這是雙向凝膠電泳技術(shù)上的一個非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10~100kD分子量的蛋白質(zhì)。

其中靈敏度較高的銀染色法可檢測到4ng蛋白，最靈敏的還是用同位素標(biāo)記，20ppm的標(biāo)記蛋白就可通過其熒光或磷光的強(qiáng)度而測定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數(shù)字化，再經(jīng)過計算機(jī)處理，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，就可以給出所有蛋白斑點的準(zhǔn)確位置和強(qiáng)度，得到布滿蛋白斑點的圖像，即所謂"參考膠圖譜"。蛋白質(zhì)組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白，進(jìn)行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再進(jìn)行分析，確定它們是已知還是未知蛋白?，F(xiàn)在的分級分析法是先做快速的氨基酸組成分析，也可先做4~5個循環(huán)的N末端微量測序，再做氨基酸組成分析;結(jié)合在電泳膠板上估計的等點電和分子量，查對數(shù)據(jù)庫中已知蛋白的數(shù)據(jù)，即可作出判斷。有文獻(xiàn)報道，N末端4個殘基序列的數(shù)據(jù)就可以給出很多的信息而得到相當(dāng)準(zhǔn)確的結(jié)果。如再結(jié)合C末端序列，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會更高。對分離得到的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步的確切鑒定需要有足夠數(shù)量的純蛋白，電泳時蛋白質(zhì)已經(jīng)過了高度純化?，F(xiàn)在一塊膠板可允許上到高達(dá)mg數(shù)量級的樣品，因此每個分離的蛋白斑點可有μg數(shù)量的蛋白，這樣使本來是微量的蛋白也可希冀被鑒定。