變性梯度聚丙烯酰胺凝膠原理

雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一個幾百個堿基對的DNA片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成（圖1）。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加達(dá)到其最低的解鏈區(qū)域濃度時，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對發(fā)生解鏈。當(dāng)濃度度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域濃度時，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到變性劑濃度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域濃度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。

不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈濃度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦DNA片段遷移到一特定位置，其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時，雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA片段會在膠中不同位置處達(dá)到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈濃度，因此它們會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。然而，一旦變性劑濃度達(dá)到DNA片段最高的解鏈區(qū)域溫度時，DNA片段會完全解鏈，成為單鏈DNA分子，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此如果不同DNA片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個堿基對）可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。

PAM沉淀的技術(shù)流程

沉淀是發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時生成了不溶于反應(yīng)物所在溶液的物質(zhì)。從字意上理解就是在重力作用下沉淀去除。污水中的懸浮物質(zhì)，可以這是一種物理過程，簡便易行，效果良好，是污水處理的重要技術(shù)之一。

根據(jù)懸浮物質(zhì)的性質(zhì)、濃度及絮聚丙烯酰胺凝性能，沉淀可以分為：自然沉淀，絮凝沉淀，區(qū)域沉淀。域沉淀的懸浮顆泣濃度較高(5000mg/L以上)，顆粒的沉降受到周圍其它顆粒影響，顆粒間相對位置保持不變，形成一個整體共同下沉，與澄清水之間有清晰的泥水界面。二次沉淀池與污泥濃縮池中均有區(qū)域沉淀發(fā)生。

廢水中懸浮固體濃度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉淀過程中，固體顆粒不改變形狀，也不互相粘合，各自獨立地完成沉淀過程。（沉砂池和初沉池的初期沉淀）壓縮沉淀發(fā)生在高濃度懸浮顆粒的沉降過程中，由于懸浮顆粒濃度很高，顆粒相互之間已擠集成團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，互相接觸，互相支承，下層顆粒間的水在上層顆粒的重力作用下被擠出，使污泥得到濃縮。二沉池污泥斗中的聚丙烯酰胺濃縮過程以及在濃縮池中污泥的濃縮過程存在壓縮沉淀。自由沉淀發(fā)生在水中懸浮固體濃度不高，沉淀過程懸浮固體之間互不干擾，顆粒各自單獨進(jìn)行沉淀，顆粒的沉淀軌跡呈直線。整個沉淀過程中，顆粒的物理性質(zhì)，如形狀，大小及比重等不發(fā)生變化。這種顆粒在沉砂池中的沉淀是自由沉淀。聚丙烯酰胺

廢水中懸浮固體濃度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉淀過程中，固體顆粒不改變形狀，也不互相粘合，各自獨立地完成沉淀過程。（沉砂池和初沉池的初期沉淀）壓縮沉淀發(fā)生在高濃度懸浮顆粒的沉降過程中，由于懸浮顆粒濃度很高，顆粒相互之間已擠集成團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，互相接觸，互相支承，下層顆粒間的水在上層顆粒的重力作用下被擠出，使污泥得到濃縮。二沉池污泥斗中的濃縮過程以及在濃縮池中污泥的濃縮過程存在壓縮聚丙烯酰胺沉淀。

絮凝沉淀是顆粒物在水中作絮凝沉淀的過程。在水中投加混凝劑后，其中懸浮物的膠體及分散顆粒在分子力的相互作用下生成絮狀體且在沉降過程中它們互相碰撞凝聚，其尺寸和質(zhì)量不斷變大，沉速不斷增加。懸浮物的去除率不但取決于沉淀速度，而且與沉淀深度有關(guān)。地面水中投加混凝劑后形成的礬花，生活污水中的有機懸浮物，活性污泥在沉淀過程中都會出現(xiàn)絮凝沉淀的現(xiàn)象。

用途　

1)用于污泥脫水根據(jù)污泥性質(zhì)可選用本產(chǎn)品的相應(yīng)型號，可有效在污泥進(jìn)入壓濾之前進(jìn)行污泥脫水，脫水時，產(chǎn)生絮團(tuán)大，不粘濾布，壓濾時不散，流泥餅較厚，脫水效率高，泥餅含水率在80%以下。

2)用于生活污水和有機廢水的處理，本產(chǎn)品在配性或堿性介質(zhì)中均呈現(xiàn)陽電性，這樣對污水中懸浮顆粒帶陰電荷的污水進(jìn)行絮凝沉淀，澄清很有效。如生產(chǎn)糧食酒精廢水，造紙廢水，城市污水處理廠的廢水，啤酒廢水，味精廠廢水，制糖廢水，有機含量高 廢水、飼料廢水，紡織印染廢水等，用陽離子聚丙烯酰胺要比用陰離子、非離子聚丙烯酰胺或無機鹽類效果要高數(shù)倍或數(shù)十倍，因為這類廢水普遍帶陰電荷。

3)用于以江河水作水源的自來水的處理絮凝劑，用量少，效果好，成本低，特別是和無機絮凝劑復(fù)合使用效果更好，它將成為治長江、黃河及其它流域的自來水廠的高效絮凝劑。

4)造紙用增強劑及其它助劑。提高填料、顏料等存留率、紙張的強度。

5)用于油田經(jīng)學(xué)助劑，如粘土防膨劑，油田酸化用稠化劑。

6)用于紡織上漿劑、漿液性能穩(wěn)定、落漿少、織物斷頭率低、布面光潔。

?（PAM）

（1）PAM合成工藝。PAM主要原料為丙烯腈，它與水經(jīng)一定比例混合，經(jīng)水合、提純、聚合、干燥等工藝可得到成品。

（2）PAM的選擇。通過多次實驗和實際應(yīng)用可以作出下列結(jié)論：陰離子型PAM適用于濃度較高的帶正電荷的無機懸浮物，以及懸浮粒子較粗（0.01-1mm），pH值為中性或堿性溶液。陰離子型PAM適用于帶負(fù)電荷、含有機物質(zhì)的懸浮物。非離子型PAM適用于有機、無機混合狀態(tài)的懸浮物分離，溶液呈酸性或中性。

（3）影響PAM絮凝作用的主要因素

1） 絮凝劑的用量：最佳的絮凝劑用量是絮凝劑全部被吸附在固相粒子表面上，且絮塊的沉降速度達(dá)到最大值。最佳用量隨著絮凝劑的離子性質(zhì)、分子量、懸浮液的pH值而變化，可用試驗方法確定。當(dāng)絮凝劑超過最佳用量時，絮凝效果反而下降。

2） 絮凝劑分子量對絮凝的影響：絮凝劑分子量越大，絮凝效果越好。但分子量太大，難于溶解且制造費用也高。常用的分子量為300-1500萬。

3） 攪拌對絮凝的影響：攪拌可使絮凝劑均勻的分散到懸浮液中，達(dá)到高效絮凝。但攪拌過于劇烈，會使形成的絮塊碎裂，因而絮凝劑的消耗量增加，而絮凝效果相對講是降低了。所以在絮凝處理時只能進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄嚢?，攪拌機轉(zhuǎn)速一般應(yīng)控制在50-250r/min。

變性梯度聚丙烯酰胺凝膠（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA片段中的點突變。Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。

聚丙烯酰胺簡稱酰胺，又名絮凝劑，英文代號（PAM）。主要分類：陰離子聚丙烯酰胺（APAM），陽離子聚丙烯酰胺（CPAM），非離子聚丙烯酰胺（NPAM）。它被廣泛應(yīng)用在石油開采、水處理、紡織、印染、造紙、選礦、洗煤、醫(yī)藥、制糖、養(yǎng)殖、建材、農(nóng)業(yè)等行業(yè)。被譽為“百業(yè)助劑”、同時又有“萬能產(chǎn)品”之稱。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是根據(jù)寡核苷酸的大小來分離，因此可將全長產(chǎn)物與不完整的短分子分開。電泳時通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，電泳后在紫外燈下定位寡核苷酸條帶，將長度正確的寡核苷酸從凝膠上切下。原理:蛋白質(zhì)或多肽與SDS結(jié)合，經(jīng)熱變性和二硫鍵的還原，形成所帶負(fù)電荷相對一致的非折疊衍生物，其泳動速度主要由分子量決定。

?變性聚丙烯酰胺凝膠是分子生物學(xué)常用技術(shù)之一，凝膠的灌制比水平電泳槽凝膠灌制困難，漏膠和產(chǎn)生氣泡常在所難免，需經(jīng)過反復(fù)實踐才能掌握其灌制技巧。我們在用mRNA差異顯示技術(shù)篩選成人難治性腎病與激素敏感性腎病綜合征患者間差異基因的實驗中，運用變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離PCR產(chǎn)物條帶，硝酸銀染色顯示條帶進(jìn)而篩選兩者間差異基因。