車(chē)蘿卜

β-胡蘿卜素在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域有廣泛用途。為獲得生產(chǎn)β-胡蘿卜素的微生物細(xì)胞工廠,本研究首先在釀酒酵母BY4742中過(guò)表達(dá)甲羥戊酸（MVA）途徑的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因及二萜化合物合成的關(guān)鍵酶牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）基因,來(lái)提高牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）的供給。在釀酒酵母底盤(pán)菌BY4742-T2的基礎(chǔ)上整合來(lái)源于成團(tuán)泛菌和紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成基因,比較釀酒酵母工程菌生產(chǎn)β-胡蘿卜素的差別。結(jié)果表明提高釀酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表達(dá)能將工程菌中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高26.0倍。另外,來(lái)源于真核生物紅法夫酵母的合成基因相比成團(tuán)泛菌,更有利于釀酒酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素。最終獲得的釀酒酵母工程菌BW02能生產(chǎn)1.56 mg/g細(xì)胞干重的β-胡蘿卜素,為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素細(xì)胞工廠提供基礎(chǔ)。

甘油是生物柴油的副產(chǎn)物,因其價(jià)格低廉和高還原性,成為生物發(fā)酵的重要碳源.為了進(jìn)一步提高工程菌對(duì)甘油的利用能力,從而提高萜類(lèi)化合物的合成能力,本研究從β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌CAR015出發(fā),對(duì)其甘油代謝途徑的多個(gè)基因進(jìn)行了調(diào)控.首先敲除了編碼3-磷酸甘油抑制子的glpR基因,然后分別用M1-37、M1-46和M1-93三個(gè)不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件對(duì)glpFK,glpD和tpiA三組基因進(jìn)行單基因調(diào)控和多基因組合調(diào)控.研究發(fā)現(xiàn)用M 1-46調(diào)控glpD基因后p-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100％;調(diào)控tpipA基因后β-胡蘿卜素產(chǎn)量略有提高;調(diào)控glpFK基因后p-胡蘿卜素產(chǎn)量略有降低.說(shuō)明G1pD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟.Q-PCR結(jié)果表明,降低甘油代謝途徑的glpD和glpFK基因轉(zhuǎn)錄水平,增加tpiA基因轉(zhuǎn)錄水平,可以增加細(xì)胞生長(zhǎng)速度、提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量,可能是因?yàn)闇p少了丙酮醛毒性所致.組合調(diào)控glpD和tpiA基因,獲得β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株Gly003,其p-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)72.45 mg/L,產(chǎn)率達(dá)18.65 mg/g每克干細(xì)胞,分別是出發(fā)菌株CAR015的5.23倍和1.99倍.總之,GlpD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟,適當(dāng)強(qiáng)度調(diào)控glpD,可以有效提高重組大腸桿菌的p-胡蘿卜素產(chǎn)量.