疏水色譜分離技術(shù)歷史研究

關(guān)于在疏水色譜分離技術(shù)進(jìn)行分離的概念最早在1948年就由Tiselius提出，“疏水作用”一詞是Kauzmann于1959年首次在“蛋白質(zhì)進(jìn)展”雜志中提出的，隨后陸續(xù)有學(xué)者發(fā)表用疏水層析成功分離蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道；如鈣調(diào)蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。該技術(shù)真正得到發(fā)展和應(yīng)用是在20世紀(jì)70年代早期開發(fā)出一系列適合進(jìn)行疏水作用色譜的固定相以后。1972年，Erel Z.等人將不同鏈長的α，ω-二胺同系物鍵合在瓊脂糖上，以不同pH的含鹽緩沖液作流動(dòng)相成功純化了糖原磷酸化酶，開始確立了疏水層析在分離純化某些疏水蛋白質(zhì)、肽類等生物大分子的重要作用。此后隨著新型色譜介質(zhì)的開發(fā)生產(chǎn)和對(duì)機(jī)理認(rèn)識(shí)的逐步深人，該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，并且隨著高效疏水作用色譜介質(zhì)的出現(xiàn)，HIC已在HPLC平臺(tái)上被使用，稱為高效疏水作用色譜（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。

疏水色譜分離技術(shù)是利用樣品中各組分具有不同的疏水作用的性質(zhì)進(jìn)行分離，主要分離對(duì)象是蛋白質(zhì)。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動(dòng)相多采用高濃度鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強(qiáng)的疏水性和有機(jī)流動(dòng)相引起蛋白質(zhì)的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質(zhì)的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團(tuán)，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動(dòng)相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動(dòng)相中進(jìn)行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團(tuán)和固定相的疏水基團(tuán)作用而被保留。當(dāng)用流動(dòng)相洗脫時(shí)逐漸降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，洗脫能力增強(qiáng)。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會(huì)失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動(dòng)相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動(dòng)相的組成使蛋白質(zhì)得到分離 。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。

研制和開發(fā)新型的色譜填料仍是HIC 發(fā)展的技術(shù)核心。從疏水色譜填料的基質(zhì)來看, 填料包括無機(jī)和有機(jī)填料兩種。

無機(jī)填料: 無機(jī)填料中, 硅膠在HIC 應(yīng)用較廣泛, 其優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能好, 孔結(jié)構(gòu)和表面積易于控制, 并有較好的化學(xué)穩(wěn)定性。但硅膠的pH 值應(yīng)用范圍較窄( 2. 0~ 8. 0) , 且硅膠表面上的硅羥基可對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附。另外, 硅羥基的解離可使填料具有陽離子交換性質(zhì), 使分離產(chǎn)生混合機(jī)理。

近年來, 多用高分子涂層硅膠填料替代單純硅膠填料。這種填料選用合適的聚合物、寡聚物或單體, 在硅膠表面形成致密的聚合物涂層, 使其既具有高聚物的化學(xué)穩(wěn)定性, 又具有硅膠基質(zhì)的高機(jī)械強(qiáng)度。

有機(jī)填料: 在有機(jī)物填料中, 多聚糖( 如瓊脂糖) 最常用, 它具有表面基團(tuán)豐富、pH 使用范圍較寬及與生物大分子良好的相容性等優(yōu)點(diǎn), 但其機(jī)械強(qiáng)度不能用于高壓疏水色譜。另外, 在與配基偶聯(lián)時(shí),常需劇毒CNBr 活化, 且工藝較復(fù)雜。近年來, 有學(xué)者嘗試用殼聚糖為基質(zhì)研制疏水色譜填料, 并成功用于A-淀粉酶、雞卵類黏蛋白的分離純化。疏水色譜填料配基的一個(gè)重要特征是具有弱疏水性, 與蛋白質(zhì)作用溫和, 從而能保證蛋白質(zhì)的生物活性不喪失。疏水色譜填料配基密度較低, 碳鏈長度一般在C-Cs 之間。烷基、苯基是常用的HIC 填料配基。如果結(jié)合力過強(qiáng), 蛋白質(zhì)難以洗脫, 需用一些高離液序列鹽類( Chaotropic salt) 或有機(jī)溶劑洗脫,但此時(shí)蛋白質(zhì)易喪失生物學(xué)活性 。

疏水色譜分離技術(shù)介質(zhì)的選擇

在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離物質(zhì)分子量很大，且樣品量較大，則應(yīng)選大孔基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠；若待分離物質(zhì)較小，或樣品量很小，但分辨率的要求高，則可選孔徑小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)。

HIC介質(zhì)中，烷基配基的鏈長大多在C4～C8之間，苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，因與溶質(zhì)發(fā)生π-π相互作用，它與戊基有不同的選擇性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基與苯基之間 。

疏水色譜分離技術(shù)樣品的準(zhǔn)備

往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)到與流動(dòng)相A（平衡液）中基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件 ，同時(shí)選擇適當(dāng)濃度及pH的緩沖液。

HIC的樣品體積受樣品中組分濃度和介質(zhì)的結(jié)合容量的影響，對(duì)于稀釋樣品無需濃縮可以直接加樣。

層析條件的優(yōu)化

優(yōu)化目標(biāo)：

目標(biāo)分子達(dá)所需純度的基礎(chǔ)上，獲得盡可能高的回收率，同時(shí)力求縮短分離所需時(shí)間、降低分離成本。

HIC中，層析條件包括流動(dòng)相A，流動(dòng)相B，洗脫方式，層析柱的柱長，流速，溫度等 。

流動(dòng)相A的緩沖液的種類、pH ，鹽的種類和濃度的選擇：

緩沖液種類據(jù)所需的pH選擇，注意目標(biāo)物的穩(wěn)定性，濃度一般在0.01--0.05mol/L；

不同鹽類對(duì)疏水作用的強(qiáng)度有影響，層析中的選擇性也不盡相同；鹽濃度也隨目標(biāo)分子的疏水性而異，(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl為1～4mol/L；

流動(dòng)相B為含鹽量較低的緩沖液，緩沖液類型與流動(dòng)相A一致。

洗脫的方式：

采用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫（最常用）；

通過往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑 ，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫 （溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)）；

往流動(dòng)相中添加去污劑等 ，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來（分離膜蛋白）。

洗脫理論：

疏溶劑理論：1976年由Sinanoglu等人提出，認(rèn)為由于溶質(zhì)分子有減少其與水接觸的非極性表面的傾向，而增加了與疏水配基結(jié)合的概率。

自由能分離理論：1979年Vanoss等人提出，認(rèn)為生物體界面自由能比水低，與配基產(chǎn)生范德華力，這個(gè)引力隨溶液鹽析能力的改變而改變。

熵分離理論：1984年Regnier提出，認(rèn)為高鹽溶液中，蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的鄰近分子是有序排列，疏水部分易于配基結(jié)合，減弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥開，使體系熵增加 。

疏水色譜分離技術(shù)層析介質(zhì)的再生、貯存

再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進(jìn)行清洗，NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時(shí)還能使微生物鈍化滅活起到消毒的效果。此外，促溶鹽類的水溶液也是良好的清洗劑。

貯存：一般懸浮在20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物的生長。

疏水色譜分離技術(shù)鹽類和鹽組成

鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有最為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。

疏水色譜分離技術(shù)離子強(qiáng)度

離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來提高組分的解析附能力。

HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。

疏水色譜分離技術(shù)溶液的酸堿度

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。

疏水色譜分離技術(shù)柱溫

一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過提高柱溫來增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。2100433B

疏水作用色譜是利用樣品中各組分具有不同的疏水作用的性質(zhì)進(jìn)行分離，主要分離對(duì)象是蛋白質(zhì)。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動(dòng)相多采用高濃度鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強(qiáng)的疏水性和有機(jī)流動(dòng)相引起蛋白質(zhì)的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質(zhì)的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團(tuán)，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動(dòng)相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動(dòng)相中進(jìn)行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團(tuán)和固定相的疏水基團(tuán)作用而被保留。當(dāng)用流動(dòng)相洗脫時(shí)逐漸降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，洗脫能力增強(qiáng)。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會(huì)失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動(dòng)相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動(dòng)相的組成使蛋白質(zhì)得到分離。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段 。

疏水作用色譜保留機(jī)理與反相色譜基本相同，所不同的是其固定相的疏水性不如反相固定相強(qiáng)，多為低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。疏水作用色譜主要用于蛋白質(zhì)的分離與純化。2100433B

疏水作用色譜法h川raphohir intert3}tion rhromato}raphy使用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，藉疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

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