硫色素熒光反應(yīng)方法

取當天配制的1.0%鐵氰化鉀溶液4.0ml，加3.5mol/L的氫氧化鈉溶液制成100ml，于4h內(nèi)使用。

精密稱取維生素Bl對照品約25mg，溶于300ml的稀醇溶液(1→5)，用3mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH4.0，加稀醇稀釋成1000ml，作為貯備液。避光冷藏，每月配制一次。取貯備液適量，用0.2mol/L鹽酸溶液逐步定量稀釋至0.2µg/ml的溶液。

取供試品適量，用0.2mol/L鹽酸溶液溶解制成100µg/ml的溶液(若供試品難溶，可在水浴上加熱使溶解)，精密量取5ml，逐步定量稀釋至0.2µg/ml的溶液。

取40ml具塞試管(或其他合適容器)3支或3支以上，各精密加入對照品溶液5ml，于其中2支(或2支以上)試管中迅速(1~2s內(nèi))加入氧化劑各3.0ml，在30s內(nèi)再加入異丁醇20.0ml，密塞，劇烈振搖90s。于另一文試管中加3.5mol/L 氫氧化鈉溶液3.0ml以代替氧化試劑，并照上述方法操作，作為空白。

另取3支或3支以上的相同試管，各精密加入供試品溶液5ml，照上述對照品溶液管的方法，同法處理。

于上述6支或6支以上試管中，各加入無水乙醇2ml，旋搖數(shù)秒鐘，待分層后，取上層澄清的異丁醇液約10ml，置熒光計測定池內(nèi)，測定其熒光強度(熒光計的輸入和輸出的最大波長分別為365nm和435nm)。

維生素B1在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，用異丁醇提取后，在紫外光(λex365m)照射下呈現(xiàn)藍色熒光(λem435m)。通過與對照品比較熒光強度，即可求得供試品含量。

維生素B1結(jié)構(gòu)中噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，然后與嘧啶環(huán)上的氨基(-NH2)縮合生成具有熒光的硫色素，后者易溶于異丁醇中顯強烈的藍色熒光，該反應(yīng)又稱為硫色素熒光反應(yīng)。此反應(yīng)為維生素B1所特有，也是其專屬檢測分析反應(yīng)

5ml供試品溶液中維生素B1的µg數(shù)=(A﹣b)/(S﹣d)×0.2×5

式中，A和S分別為供試品溶液和對照品溶液側(cè)得的平均熒光讀數(shù);b和d分別為其相應(yīng)的空白讀數(shù);0.2為對照品溶液的濃度(µg/ml);5為測定時對照品溶液的取樣體積(ml)。

(1)硫色素反應(yīng)為維生素Bl的專屬反應(yīng)，雖非定量完成，促在一定條件下形成的硫色素與維生素Bl濃度成正比，且回收恒定。故可用于維生素Bl及其制劑的含量測定。

(2)本法為維生素B1所特有，故不受氧化破壞產(chǎn)物的干擾，測定結(jié)果較為準確。但操作繁瑣，且熒光測定受多種因素干擾;

(3)本法中使用的氧化劑，除鐵氰化鉀外、尚可用氯化汞或溴化氰。其中，溴化氰能將維生素Bl完全定量地氧化為硫色素，在較寬的濃度范圍內(nèi)與熒光強度成正比，且尿液中某些代謝產(chǎn)物不干擾測定。故亦適用于臨床體液分析。