濃度時間常數(shù)

?為避免電流衰減(rundown)現(xiàn)象的影響，電極內(nèi)液中加入ATP，并控制實驗在細胞破膜后25分鐘內(nèi)完成。根據(jù)實驗設(shè)計，將配制好的藥物溶液，用恒流蠕動泵以2ml/分鐘速度向細胞灌流槽分別灌流，同時使用整負壓吸引裝置將廢液從灌流槽中吸除。記錄方法為破膜后穩(wěn)定5分鐘記錄給藥前的電流值，給藥5分鐘后記錄藥物作用下的電流值。采樣后數(shù)據(jù)存貯在電腦硬盤內(nèi)，供測量及分析用。為消除細胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。

用急性酶解法制備心室肌單個細胞。取大鼠用50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，開胸取出心臟，在4℃無鈣Tyrode液中去除脂肪和心包膜，分離主動脈并插管，行Langendorff心臟灌流(圖1)，速度為6~8ml/min。先以無鈣臺氏液灌流3分鐘(灌注壓為20cm水柱)，洗凈冠脈內(nèi)血液，再用低鈣酶解液(CaCl2為0.05mmol/L低鈣臺氏液,含Ⅱ型膠原酶0.4mg/ml，鏈蛋白酶E0.04mg/ml)循環(huán)灌流，大約20分鐘后，將心臟從Langendorff裝置上取下，置入室溫KB液中，剪去心房和基底部的組織，持眼科鑷將心室組織輕輕撕拉，用粗開口的吸管緩慢吹打，使心肌細胞從心肌組織上脫離，獲得單個心室肌細胞,上清液用120目的尼龍過濾網(wǎng)過濾，心肌細胞收藏在含KB液的試管中。整個灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有的灌流液和KB液均通以100\%的O2飽和30分鐘以上。將細胞在室溫下靜置半小時左右復(fù)鈣至0.25mmol/L，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

吸取少許富含細胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5~10分鐘，待細胞沉底附壁后，用100\%O2飽和的細胞外液實驗前吸取少許富含細胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5~10分鐘，待細胞沉底附壁后，用100\%O2飽和的細胞外液進行表面灌流5~10分鐘，流速約2ml/分鐘。在倒置顯微鏡(OLYMPUS1×70)下選擇邊緣清楚、表面光滑、橫紋清晰、無收縮的細胞。實驗在22~24℃室溫下進行。采用Hamill等人的標準全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄通道電流。膜片鉗放大器(Axopatch700B，美國Axon公司)，通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(Digidata1322，美國Axon公司)同計算機相連接。刺激信號及電壓、電流輸入信號的采集均由軟件(pClampex10.0，美國Axon公司)控制。玻璃毛胚管(中國科學(xué)院物理所提供)經(jīng)微電極拉制儀(p-97，美國Sutter公司)進行4步拉制而成，經(jīng)拋光儀(MF-830，日本Narishige公司)拋光后尖端直徑2~3μm。充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1.5~3MΩ，補償液接電位后，調(diào)節(jié)三維操縱器(mhw-3，日本NARISHIGE公司)使電極尖端移向細胞表面，形成高阻封接(gigaseal)，封接電阻為1GΩ以上。補償快電容并吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。電容測定時給予-10mV躍階的刺激，采用Cm=τ·Iss/△V求膜電容。調(diào)節(jié)慢電容補償和串聯(lián)電阻補償80\%~90\%以減少瞬時充放電電流和鉗位誤差。信號經(jīng)截止頻率為1kHz的4階貝塞爾低通濾波器，采樣率為10kHz。