濃度時(shí)間常數(shù)基本簡(jiǎn)介

?為避免電流衰減(rundown)現(xiàn)象的影響，電極內(nèi)液中加入ATP，并控制實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞破膜后25分鐘內(nèi)完成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將配制好的藥物溶液，用恒流蠕動(dòng)泵以2ml/分鐘速度向細(xì)胞灌流槽分別灌流，同時(shí)使用整負(fù)壓吸引裝置將廢液從灌流槽中吸除。記錄方法為破膜后穩(wěn)定5分鐘記錄給藥前的電流值，給藥5分鐘后記錄藥物作用下的電流值。采樣后數(shù)據(jù)存貯在電腦硬盤(pán)內(nèi)，供測(cè)量及分析用。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。

用急性酶解法制備心室肌單個(gè)細(xì)胞。取大鼠用50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，開(kāi)胸取出心臟，在4℃無(wú)鈣Tyrode液中去除脂肪和心包膜，分離主動(dòng)脈并插管，行Langendorff心臟灌流(圖1)，速度為6~8ml/min。先以無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流3分鐘(灌注壓為20cm水柱)，洗凈冠脈內(nèi)血液，再用低鈣酶解液(CaCl2為0.05mmol/L低鈣臺(tái)氏液,含Ⅱ型膠原酶0.4mg/ml，鏈蛋白酶E0.04mg/ml)循環(huán)灌流，大約20分鐘后，將心臟從Langendorff裝置上取下，置入室溫KB液中，剪去心房和基底部的組織，持眼科鑷將心室組織輕輕撕拉，用粗開(kāi)口的吸管緩慢吹打，使心肌細(xì)胞從心肌組織上脫離，獲得單個(gè)心室肌細(xì)胞,上清液用120目的尼龍過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，心肌細(xì)胞收藏在含KB液的試管中。整個(gè)灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有的灌流液和KB液均通以100\%的O2飽和30分鐘以上。將細(xì)胞在室溫下靜置半小時(shí)左右復(fù)鈣至0.25mmol/L，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

吸取少許富含細(xì)胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5~10分鐘，待細(xì)胞沉底附壁后，用100\%O2飽和的細(xì)胞外液實(shí)驗(yàn)前吸取少許富含細(xì)胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5~10分鐘，待細(xì)胞沉底附壁后，用100\%O2飽和的細(xì)胞外液進(jìn)行表面灌流5~10分鐘，流速約2ml/分鐘。在倒置顯微鏡(OLYMPUS1×70)下選擇邊緣清楚、表面光滑、橫紋清晰、無(wú)收縮的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)在22~24℃室溫下進(jìn)行。采用Hamill等人的標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄通道電流。膜片鉗放大器(Axopatch700B，美國(guó)Axon公司)，通過(guò)A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(Digidata1322，美國(guó)Axon公司)同計(jì)算機(jī)相連接。刺激信號(hào)及電壓、電流輸入信號(hào)的采集均由軟件(pClampex10.0，美國(guó)Axon公司)控制。玻璃毛胚管(中國(guó)科學(xué)院物理所提供)經(jīng)微電極拉制儀(p-97，美國(guó)Sutter公司)進(jìn)行4步拉制而成，經(jīng)拋光儀(MF-830，日本Narishige公司)拋光后尖端直徑2~3μm。充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1.5~3MΩ，補(bǔ)償液接電位后，調(diào)節(jié)三維操縱器(mhw-3，日本NARISHIGE公司)使電極尖端移向細(xì)胞表面，形成高阻封接(gigaseal)，封接電阻為1GΩ以上。補(bǔ)償快電容并吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。電容測(cè)定時(shí)給予-10mV躍階的刺激，采用Cm=τ·Iss/△V求膜電容。調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償80\%~90\%以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗位誤差。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1kHz的4階貝塞爾低通濾波器，采樣率為10kHz。