疏水吸附疏水層析的條件

① 對(duì)疏水吸附劑的選擇根據(jù)樣品特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的疏水吸附劑。用一組柱，如Seph-Cn(n=1-10)，層析樣品，看樣品的吸附情況。隨著碳鏈的增長，蛋白質(zhì)吸附量也增加，但洗脫條件亦隨之變得劇烈。要選擇能完全吸附目的蛋白質(zhì)，但洗脫條件又比較溫和的疏水曬附劑。

② 對(duì)吸附條件的選擇為了使目的蛋白質(zhì)能緊密地結(jié)合在柱床上，要選擇合適的緩沖濃離子強(qiáng)度和pH。上柱的樣品溶液應(yīng)含有一定濃度的中性鹽，以增加目的蛋白質(zhì)與疏水吸附劑的疏水相互作用。一般要在較高的離子強(qiáng)度(4mol/L NaCl)下吸附目的蛋白質(zhì)。

③ 對(duì)洗脫條件的選擇用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液可以將不同的蛋白質(zhì)從吸附劑上先后洗脫下來。有各種洗脫方法：降低緩沖液的離子強(qiáng)度；增加緩沖液的pH；加乙二醇降低洗脫液的極性；在洗脫液中加去污劑；改用低鹽析效應(yīng)的鹽。上述洗脫方法，有的直接破壞疏水相互作用；有的通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象起作用。通常，用由高到低的NaCl濃度梯度洗脫，或者，由高到低的鹽濃度梯度加上由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。

疏水作用吸附需要使用疏水作用的吸附劑，它與其他吸附技術(shù)所用的吸附劑相類似，由作為骨架的基質(zhì)和鍵合在基質(zhì)上參與疏水作用的配基組成。

①基質(zhì)可分為“軟基質(zhì)”，其中以瓊脂糖使用最廣泛，另外還有葡聚糖、高分子聚合物和纖維素等；“硬基質(zhì)”主要是大孔徑硅膠。瓊脂糖一類凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，表面羥基密度非常大，衍生化后可產(chǎn)生取代程度和結(jié)合容量較大的吸附劑，其大孔結(jié)構(gòu)適合于大分子蛋白質(zhì)的分離，且pH值穩(wěn)定性良好。硅膠的特點(diǎn)是硬度大，機(jī)械穩(wěn)定性高，但其表面可供衍生的基團(tuán)少，且僅在pH值2～8范圍內(nèi)穩(wěn)定，因此其應(yīng)用受到限制。但后來采用了聚合物包裹技術(shù)，在硅膠或其他有機(jī)聚合物表面包裹一層帶有可衍生基團(tuán)的高分子材料，從而克服了上述缺點(diǎn)，使其具備良好的分離性能，得到了廣泛的使用。

②疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基(C₃～C₈)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基與親水性基質(zhì)之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。疏水吸附劑作用與其他吸附劑不同，它們對(duì)組分的分離要比在相同情況下的離子交換色譜要好。其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量較大(10～100mg/cm)，并可重復(fù)使用，效果不變，但其使用有局限性，所能達(dá)到的分辨率也不高。

疏水吸附層析的基本材料是疏水吸附劑。疏水吸附劑是由球狀的載體與疏水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。在疏水吸附劑顆粒的表面上，分布著許多的疏水基團(tuán)。在球狀蛋白質(zhì)分子的表面上，有疏水區(qū)和疏水口袋。它是由一些疏水氨基酸殘基的疏水基團(tuán)構(gòu)成的。將懸浮于吸附緩沖液的疏水吸附劑裝進(jìn)層析柱內(nèi)，構(gòu)成柱床，然后，將溶于吸附緩沖液的樣品(蛋白質(zhì)混合物，含目的蛋白質(zhì))加入柱床。在吸附條件下，由于疏水吸附劑的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)之間的疏水相互作用，因而，使蛋白質(zhì)吸附在吸附劑的表面上。然后，改變洗脫條件，減弱疏水相互作用，從而使蛋白質(zhì)從吸附劑上解吸下來。影響疏水相互作用的因素有兩個(gè)：一是蛋白質(zhì)的疏水性。不同蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和疏水口袋，在數(shù)目、大小、形狀和親脂性上各不相同，因而與吸附劑的吸附力有差異。二是蛋白質(zhì)的環(huán)境。在水相中提高中性鹽的濃度或降低乙二醇的濃度，可以增強(qiáng)疏水基團(tuán)間相互作用力，反之，則減弱這種作用力。疏水層析，就是通過對(duì)疏水相互作用強(qiáng)弱的調(diào)控，來達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

疏水吸附層析是70年代興起的一種新技術(shù)。它對(duì)蛋白質(zhì)混合物有很好的分離效果。目前，這一技術(shù)已廣泛地用于蛋白質(zhì)及其它生物大分子的分離純化。

在親和層析載體的發(fā)展中，發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)即使不存在帶電末端(氨基或羧基)也能與1，6-亞己基間隔臂發(fā)生強(qiáng)烈的連接，這是由于在吸附劑上的脂肪族長鏈和生物分子表面上疏水區(qū)相互作用的結(jié)果，該發(fā)現(xiàn)使疏水層析技術(shù)得到了很好的應(yīng)用。

某些低水溶性的蛋白質(zhì)，如球蛋白、膜締合蛋白和其他一些在20%～40%硫酸銨飽和度時(shí)能沉淀的蛋白質(zhì)，在低鹽濃度時(shí)。能被疏水吸附劑強(qiáng)烈地吸附，但是可以通過降低溫度、加入有機(jī)溶劑、加人多元醇(特別是1，2-乙二醇)、加入非離子洗滌劑、增加離液序列高的離子(例如硫氰酸鹽)、改變pH值等方法來削弱疏水區(qū)的相互作用，使蛋白質(zhì)從吸附劑上洗脫下來。

同樣，C₄、C₈、C₁₈(脂肪鏈)和苯基取代的高效液相色譜(HPLC)柱，用于純化多肽和蛋白質(zhì)，也是建立在疏水吸附理論基礎(chǔ)上的。

這種技術(shù)已成功地用于多種酶的分離純化上，例如，用癸基或辛基的瓊脂糖柱吸附，然后用1，2-乙二醇梯度洗脫從人胎盤中分離純化葡糖腦苷脂-伊葡糖苷酶；用苯基瓊脂糖凝膠柱吸附和pH 7.6的Tris-HCI溶液遞減梯度洗脫的辦法分離純化由熒光假單胞菌產(chǎn)生的芳香?；０访?。 2100433B

吸附是指物質(zhì)在相界面上濃度自動(dòng)發(fā)生變化的現(xiàn)象，大致分為兩類：物理吸附（吸附力足范德華力）和發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的化學(xué)吸附。通常，具有吸附作用的物質(zhì)稱為吸附劑（如活性炭、硅膠、氧化鋁等），而被吸附的物質(zhì)稱為吸附質(zhì)。

吸附劑表面積越大，則吸附量就越大 所以，吸附劑都是多孔性或者是微細(xì)的物質(zhì)。

當(dāng)lg吸附劑表面上吸附1層鋪滿的吸附質(zhì)分子（飽和吸附量）時(shí)，則比表面積的計(jì)算公式為

固體的比表面積 =分子數(shù)x每個(gè)分子所占的面積

或 S_g =S/W（m²/g）

式中：S_g 為比表面積（m²/g）；S為同體物質(zhì)的總表面積（外表面 內(nèi)表面）；W為固體物質(zhì)的質(zhì)量。

因此，比表面的測(cè)定實(shí)質(zhì)上是求出某種吸附質(zhì)的單分子層飽和吸附量。

當(dāng)流體與多孔固體接觸時(shí)， 流體中某一組分或多個(gè)組分在固體表面處產(chǎn)生積蓄， 此現(xiàn)象稱為吸附。 吸附也指物質(zhì)（主要是固體物質(zhì)）表面吸住周圍介質(zhì)（液體或氣體）中的分子或離子現(xiàn)象。

在液體或氣體表面生成一層原子或分子的現(xiàn)象。被吸附的原子或分子常被化學(xué)鍵牢牢吸住，即化學(xué)吸附?；瘜W(xué)吸附中，被吸附層常為一個(gè)分子那么厚的一薄層。吸附也可通過較弱的物理力發(fā)生，即物理吸附，通常形成幾個(gè)分子層。

吸附屬于一種傳質(zhì)過程，物質(zhì)內(nèi)部的分子和周圍分子有互相吸引的引力，但物質(zhì)表面的分子，其中相對(duì)物質(zhì)外部的作用力沒有充分發(fā)揮，所以液體或固體物質(zhì)的表面可以吸附其他的液體或氣體，尤其是表面面積很大的情況下，這種吸附力能產(chǎn)生很大的作用，所以工業(yè)上經(jīng)常利用大面積的物質(zhì)進(jìn)行吸附，如活性炭、水膜等。

物理吸附的吸附熱等于吸附質(zhì)的凝縮熱與濕潤熱之和。當(dāng)前者相對(duì)于后者很大時(shí)，可忽略濕潤熱。物理吸附的吸附熱一般為幾百到幾千焦耳每摩爾，最大不超過40kJ/mol?；瘜W(xué)吸附過程的吸附熱比物理吸附過程的大，其數(shù)量相當(dāng)于化學(xué)反應(yīng)熱，一般為84-417kJ/mol。吸附溫度也會(huì)影響吸附熱的大小。在實(shí)際操作中，吸附熱會(huì)導(dǎo)致吸附層溫度升高，進(jìn)而使吸附劑平均活性下降。

吸附過程產(chǎn)生的熱為吸附熱，吸附熱的大小可以衡量吸附強(qiáng)弱的程度，吸附熱越大，吸附越強(qiáng)。

吸附熱是衡量吸附劑吸附功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。