疏水吸附基本原理

疏水吸附層析的基本材料是疏水吸附劑。疏水吸附劑是由球狀的載體與疏水基團共價結(jié)合而成的。在疏水吸附劑顆粒的表面上，分布著許多的疏水基團。在球狀蛋白質(zhì)分子的表面上，有疏水區(qū)和疏水口袋。它是由一些疏水氨基酸殘基的疏水基團構(gòu)成的。將懸浮于吸附緩沖液的疏水吸附劑裝進層析柱內(nèi)，構(gòu)成柱床，然后，將溶于吸附緩沖液的樣品(蛋白質(zhì)混合物，含目的蛋白質(zhì))加入柱床。在吸附條件下，由于疏水吸附劑的疏水基團與蛋白質(zhì)分子的疏水基團之間的疏水相互作用，因而，使蛋白質(zhì)吸附在吸附劑的表面上。然后，改變洗脫條件，減弱疏水相互作用，從而使蛋白質(zhì)從吸附劑上解吸下來。影響疏水相互作用的因素有兩個：一是蛋白質(zhì)的疏水性。不同蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和疏水口袋，在數(shù)目、大小、形狀和親脂性上各不相同，因而與吸附劑的吸附力有差異。二是蛋白質(zhì)的環(huán)境。在水相中提高中性鹽的濃度或降低乙二醇的濃度，可以增強疏水基團間相互作用力，反之，則減弱這種作用力。疏水層析，就是通過對疏水相互作用強弱的調(diào)控，來達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

疏水吸附層析是70年代興起的一種新技術。它對蛋白質(zhì)混合物有很好的分離效果。目前，這一技術已廣泛地用于蛋白質(zhì)及其它生物大分子的分離純化。

在親和層析載體的發(fā)展中，發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)即使不存在帶電末端(氨基或羧基)也能與1，6-亞己基間隔臂發(fā)生強烈的連接，這是由于在吸附劑上的脂肪族長鏈和生物分子表面上疏水區(qū)相互作用的結(jié)果，該發(fā)現(xiàn)使疏水層析技術得到了很好的應用。

疏水作用吸附需要使用疏水作用的吸附劑，它與其他吸附技術所用的吸附劑相類似，由作為骨架的基質(zhì)和鍵合在基質(zhì)上參與疏水作用的配基組成。

①基質(zhì)可分為“軟基質(zhì)”，其中以瓊脂糖使用最廣泛，另外還有葡聚糖、高分子聚合物和纖維素等；“硬基質(zhì)”主要是大孔徑硅膠。瓊脂糖一類凝膠的優(yōu)點是親水性強，表面羥基密度非常大，衍生化后可產(chǎn)生取代程度和結(jié)合容量較大的吸附劑，其大孔結(jié)構(gòu)適合于大分子蛋白質(zhì)的分離，且pH值穩(wěn)定性良好。硅膠的特點是硬度大，機械穩(wěn)定性高，但其表面可供衍生的基團少，且僅在pH值2～8范圍內(nèi)穩(wěn)定，因此其應用受到限制。但后來采用了聚合物包裹技術，在硅膠或其他有機聚合物表面包裹一層帶有可衍生基團的高分子材料，從而克服了上述缺點，使其具備良好的分離性能，得到了廣泛的使用。

②疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基(C₃～C₈)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基與親水性基質(zhì)之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合來實現(xiàn)。疏水吸附劑作用與其他吸附劑不同，它們對組分的分離要比在相同情況下的離子交換色譜要好。其優(yōu)點是對蛋白質(zhì)的吸附容量較大(10～100mg/cm)，并可重復使用，效果不變，但其使用有局限性，所能達到的分辨率也不高。

① 對疏水吸附劑的選擇根據(jù)樣品特點和實驗目的選擇合適的疏水吸附劑。用一組柱，如Seph-Cn(n=1-10)，層析樣品，看樣品的吸附情況。隨著碳鏈的增長，蛋白質(zhì)吸附量也增加，但洗脫條件亦隨之變得劇烈。要選擇能完全吸附目的蛋白質(zhì)，但洗脫條件又比較溫和的疏水曬附劑。

② 對吸附條件的選擇為了使目的蛋白質(zhì)能緊密地結(jié)合在柱床上，要選擇合適的緩沖濃離子強度和pH。上柱的樣品溶液應含有一定濃度的中性鹽，以增加目的蛋白質(zhì)與疏水吸附劑的疏水相互作用。一般要在較高的離子強度(4mol/L NaCl)下吸附目的蛋白質(zhì)。

③ 對洗脫條件的選擇用適當?shù)南疵摼彌_液可以將不同的蛋白質(zhì)從吸附劑上先后洗脫下來。有各種洗脫方法：降低緩沖液的離子強度；增加緩沖液的pH；加乙二醇降低洗脫液的極性；在洗脫液中加去污劑；改用低鹽析效應的鹽。上述洗脫方法，有的直接破壞疏水相互作用；有的通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象起作用。通常，用由高到低的NaCl濃度梯度洗脫，或者，由高到低的鹽濃度梯度加上由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。

某些低水溶性的蛋白質(zhì)，如球蛋白、膜締合蛋白和其他一些在20%～40%硫酸銨飽和度時能沉淀的蛋白質(zhì)，在低鹽濃度時。能被疏水吸附劑強烈地吸附，但是可以通過降低溫度、加入有機溶劑、加人多元醇(特別是1，2-乙二醇)、加入非離子洗滌劑、增加離液序列高的離子(例如硫氰酸鹽)、改變pH值等方法來削弱疏水區(qū)的相互作用，使蛋白質(zhì)從吸附劑上洗脫下來。

同樣，C₄、C₈、C₁₈(脂肪鏈)和苯基取代的高效液相色譜(HPLC)柱，用于純化多肽和蛋白質(zhì)，也是建立在疏水吸附理論基礎上的。

這種技術已成功地用于多種酶的分離純化上，例如，用癸基或辛基的瓊脂糖柱吸附，然后用1，2-乙二醇梯度洗脫從人胎盤中分離純化葡糖腦苷脂-伊葡糖苷酶；用苯基瓊脂糖凝膠柱吸附和pH 7.6的Tris-HCI溶液遞減梯度洗脫的辦法分離純化由熒光假單胞菌產(chǎn)生的芳香?；０访?。 2100433B

吸附是指物質(zhì)在相界面上濃度自動發(fā)生變化的現(xiàn)象，大致分為兩類：物理吸附（吸附力足范德華力）和發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的化學吸附。通常，具有吸附作用的物質(zhì)稱為吸附劑（如活性炭、硅膠、氧化鋁等），而被吸附的物質(zhì)稱為吸附質(zhì)。

吸附劑表面積越大，則吸附量就越大 所以，吸附劑都是多孔性或者是微細的物質(zhì)。

當lg吸附劑表面上吸附1層鋪滿的吸附質(zhì)分子（飽和吸附量）時，則比表面積的計算公式為

固體的比表面積 =分子數(shù)x每個分子所占的面積

或 S_g =S/W（m²/g）

式中：S_g 為比表面積（m²/g）；S為同體物質(zhì)的總表面積（外表面 內(nèi)表面）；W為固體物質(zhì)的質(zhì)量。

因此，比表面的測定實質(zhì)上是求出某種吸附質(zhì)的單分子層飽和吸附量。

當流體與多孔固體接觸時， 流體中某一組分或多個組分在固體表面處產(chǎn)生積蓄， 此現(xiàn)象稱為吸附。 吸附也指物質(zhì)（主要是固體物質(zhì)）表面吸住周圍介質(zhì)（液體或氣體）中的分子或離子現(xiàn)象。

在液體或氣體表面生成一層原子或分子的現(xiàn)象。被吸附的原子或分子常被化學鍵牢牢吸住，即化學吸附?；瘜W吸附中，被吸附層常為一個分子那么厚的一薄層。吸附也可通過較弱的物理力發(fā)生，即物理吸附，通常形成幾個分子層。

吸附屬于一種傳質(zhì)過程，物質(zhì)內(nèi)部的分子和周圍分子有互相吸引的引力，但物質(zhì)表面的分子，其中相對物質(zhì)外部的作用力沒有充分發(fā)揮，所以液體或固體物質(zhì)的表面可以吸附其他的液體或氣體，尤其是表面面積很大的情況下，這種吸附力能產(chǎn)生很大的作用，所以工業(yè)上經(jīng)常利用大面積的物質(zhì)進行吸附，如活性炭、水膜等。

物理吸附的吸附熱等于吸附質(zhì)的凝縮熱與濕潤熱之和。當前者相對于后者很大時，可忽略濕潤熱。物理吸附的吸附熱一般為幾百到幾千焦耳每摩爾，最大不超過40kJ/mol?；瘜W吸附過程的吸附熱比物理吸附過程的大，其數(shù)量相當于化學反應熱，一般為84-417kJ/mol。吸附溫度也會影響吸附熱的大小。在實際操作中，吸附熱會導致吸附層溫度升高，進而使吸附劑平均活性下降。

吸附過程產(chǎn)生的熱為吸附熱，吸附熱的大小可以衡量吸附強弱的程度，吸附熱越大，吸附越強。

吸附熱是衡量吸附劑吸附功能強弱的重要指標之一。