植物培養(yǎng)基制培養(yǎng)液

植物培養(yǎng)基制備母液

為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)幾十種化學(xué)藥品進(jìn)行稱(chēng)量，應(yīng)該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱(chēng)量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時(shí)，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋?zhuān)闯膳囵B(yǎng)液?，F(xiàn)將培養(yǎng)液中各類(lèi)物質(zhì)制備母液的方法說(shuō)明如下。

(1)大量元素。大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時(shí)，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱(chēng)出并進(jìn)行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達(dá)到1升，此即大量元素母液。

(2)微量元素。因用量少，為稱(chēng)量方便和精確起見(jiàn)，應(yīng)配成100倍或1000倍的母液。配制時(shí)，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。

(3)鐵鹽。鐵鹽要單獨(dú)配制。由硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(Na—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養(yǎng)基，加鐵鹽5毫升。

(4)有機(jī)物質(zhì)。主要指氨基酸和維生素類(lèi)物質(zhì)。它們都是分別稱(chēng)量，分別配成所需的濃度(0.1～1.0毫克/毫升)，用時(shí)按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。

(5)植物激素。最常用的有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。這類(lèi)物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.01～10毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制時(shí)要單個(gè)稱(chēng)量，分別貯藏。

配制植物生長(zhǎng)素時(shí)，應(yīng)先按要求濃度稱(chēng)好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克當(dāng)量濃度)氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細(xì)胞分裂素時(shí)，應(yīng)先用少量0.5或1N的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。

以上各種混合液(母液)或單獨(dú)配制藥品，均應(yīng)放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長(zhǎng)霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱(chēng)隨用。

植物培養(yǎng)基具體操作

①根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱(chēng)取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。

②將①中稱(chēng)好的瓊脂加蒸餾水300～400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。

③將①中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養(yǎng)基。

④用1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入③中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測(cè)其pH值，直到將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.8。

⑤將配好的培養(yǎng)基，用漏斗分裝到三角瓶(或試管)中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫(xiě)上號(hào)碼。瓶中培養(yǎng)基的量約為容量的1/4或1/5。

培養(yǎng)基的成分比較復(fù)雜，為避免配制時(shí)忙亂而將一些成分漏掉，可以準(zhǔn)備一份配制培養(yǎng)基的成分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫(xiě)清楚。配制時(shí)，按表列內(nèi)容順序，按項(xiàng)按量稱(chēng)取，就不會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。成分單的格式與內(nèi)容見(jiàn)表9－2。

植物培養(yǎng)基滅菌保存

培養(yǎng)基配制完畢后，應(yīng)立即滅菌。培養(yǎng)基通常應(yīng)在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在汽相120℃條件下，滅菌20分鐘。如果沒(méi)有高壓蒸汽滅菌鍋，也可采用間歇滅菌法進(jìn)行滅菌，即將培養(yǎng)基煮沸10分鐘，24小時(shí)后再煮沸20分鐘，如此連續(xù)滅菌三次，即可達(dá)到完全滅菌的目的。

經(jīng)過(guò)滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)置于10℃下保存，特別是含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基，在4～5℃低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應(yīng)超過(guò)一個(gè)月。在多數(shù)情況下，應(yīng)在消毒后兩周內(nèi)用完。2100433B

植物培養(yǎng)基常用配方

組織培養(yǎng)是否成功，在很大程度上取決于對(duì)培養(yǎng)基的選擇。不同培養(yǎng)基有不同特點(diǎn)，適合于不同的植物種類(lèi)和接種材料。開(kāi)展組織培養(yǎng)活動(dòng)時(shí)，應(yīng)對(duì)各種培養(yǎng)基進(jìn)行了解和分析，以便能從中選擇使用。下面介紹組織培養(yǎng)幾種常用培養(yǎng)基的配方見(jiàn)表9－1。

培養(yǎng)基中的激素種類(lèi)和數(shù)量，隨著不同培養(yǎng)階段和不同材料而有變化，因此各配方中均不列入。

植物培養(yǎng)基相關(guān)特點(diǎn)

(1) MS培養(yǎng)基。 MS培養(yǎng)基是普遍使用的培養(yǎng)基。它有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，對(duì)保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和加速愈傷組織的生長(zhǎng)十分有利。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不致影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，它的液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)能獲得明顯成功。這種培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿(mǎn)足植物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，無(wú)須再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的明顯特點(diǎn)。

(2) B5培養(yǎng)基。B5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這是因?yàn)殇@可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有些植物的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得比B5培養(yǎng)基上要好，而另一些植物，在B5培養(yǎng)基上更適宜。

(3)N6培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基特別適合于禾谷類(lèi)植物的花藥和花粉培養(yǎng)，在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。在組織培養(yǎng)中，經(jīng)常采用的還有懷特(While，1963)培養(yǎng)基、尼許(Nitsch，1951)培養(yǎng)基等。它們?cè)诨境煞稚洗笸‘?。懷特培養(yǎng)基由于無(wú)機(jī)鹽的數(shù)量比較低，更適合木本植物的組織培養(yǎng)。

大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是由無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類(lèi)物質(zhì)組成。

植物培養(yǎng)基無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的；磷和硫則常用磷酸鹽和硫酸鹽來(lái)提供。鉀是培養(yǎng)基中主要的陽(yáng)離子，在近代的培養(yǎng)基中，其數(shù)量有逐漸提高的趨勢(shì)。鈣、鈉、鎂的需要?jiǎng)t較少。培養(yǎng)基所需的鈉和氯化物，由鈣鹽、磷酸鹽或微量營(yíng)養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多以螯合鐵的形式存在，即FeSO4與Na2—EDTA（螯合劑）的混合。

植物培養(yǎng)基碳源

培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物以供需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源外，對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。

植物培養(yǎng)基維生素

在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養(yǎng)基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。

植物培養(yǎng)基有機(jī)附加物

包括人工合成或天然的有機(jī)附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。另外，瓊脂也是最常用的有機(jī)附加物，它主要是作為培養(yǎng)基的支持物，使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于各種外植體的培養(yǎng)。

植物培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)大致包括以下三類(lèi)：

(1)植物生長(zhǎng)素類(lèi)。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

(2)細(xì)胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動(dòng)素（Kt）。

(3)赤霉素。組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。

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