松針黃酮

不論在黃酮類化合物的提取分離方面還是在其結(jié)構(gòu)測定的研究方面，黃酮類化合物的理化性質(zhì)及其顯色反應都發(fā)揮著譜學技術(shù)所替代不了的作用。下面僅就其與分離和結(jié)構(gòu)測定密切相關的性質(zhì)進行簡要介紹。

黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)(如黃酮苷類)為無定形粉末。游離的各種苷元母核中，除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷醇有族光性外，其余則無光學活性。苷類由于在結(jié)構(gòu)中引入糖的分子，故均有旋光性，且多為左旋。黃酮類化合物的顏色與分子中是否存在交叉共軛體系及助色團(-OH、-OCH3等)的種類、數(shù)目以及取代位置有關。以黃酮為例，其色原酮部分原本元色;但在2位上引入苯環(huán)后，即形成交叉共軛體系，并通過電子轉(zhuǎn)移、重排，使共軛鏈延長，因而顯現(xiàn)出顏色。一般情況下，黃酮、黃酮醇及其苷類多顯灰黃~黃色，查耳酮為黃~橙黃色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類，因不具有交叉共軛體系或共軛鏈短，故不顯色(二氫黃酮及二氫黃酮醇)或顯微黃色(異黃酮)。顯然，在上述黃酮、黃酮醇分子中，尤其在7位及4'位引入-OH及-OCH3等助色團后，則因促進電子移位、重排，而使化合物的顏色加深。但-OH、-OCH3，引入其他位置則影響較小。

花色素及其苷元的顏色隨pH不同而改變，一般顯紅( pH 7)、紫( pH= 8.5)藍( pH> 8.5)等顏色。

黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)(苷和苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷)不同而有很大差異。一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醇等有機溶劑及稀堿水溶液中。其中黃酮、黃酮醇、查耳酮等平面性強的分子，因分子與分子間排列緊密，分子間引力較大，故更難溶于水;而二氫黃酮及二氫黃酮醇等，因系非平面性分子，故分子與分子間排列不緊密，分子間引力降低，有利于水分子進入，溶解度稍大。

至于花色苷元(花青素)類雖也為平面性結(jié)構(gòu)，但因以離子形式存在，具有鹽的通性，故親水性較強，水中溶解度較大。

黃酮類苷元分子中引入羥基，將增加在水中的溶解度;而羥基經(jīng)甲基化后，則增加在有機溶劑中的溶解度。例如，一般黃酮類化合物不溶于石油醚中，故可與脂溶性雜質(zhì)分開，但川陳皮素(5，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黃酮)卻可溶于石油醚。

黃酮類化合物的羥基糖苷化后，水中溶解度即相應加大，而在有機溶劑中的溶解度則相應減小。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等強極性溶劑中;但難溶或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中。糖鏈越長，則水中溶解度越大。

另外，糖的結(jié)合位置不同，對苷的水中溶解度也有一定影響:以棉黃素(3，5，7，8，3'，4'-六羥基黃酮)為例，其3-O-葡萄糖苷的水中溶解度大于7-O-葡萄糖苷。

黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基，故顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。

由于酚羥基數(shù)目及位置不同，酸性強弱也不同，以黃酮為例，其酚羥基酸性強弱順序依次為:

7，4'-二羥基>7或4'-羥基>一般酚羥基>5-羥基

例如C7-OH因為處于C=O的對位，在p-共軛效應的影響下，酸性較強，可溶于碳酸鈉水溶液中，此性質(zhì)可用于提取、分離及鑒定工作。

7-吡喃環(huán)上的1位氧原子，因有未共用的電子對，故表現(xiàn)微弱的堿性，可與強無機酸，如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但生成的樣鹽極不穩(wěn)定，加水后即可分解。

黃酮類化合物溶于濃硫酸中生成的樣鹽，常常表現(xiàn)出特殊的顏色，可用于鑒別。某些甲氧基黃酮溶于濃鹽酸中顯深黃色，且可與生物堿沉淀試劑生成沉淀。

黃酮類化合物的顏色反應多與分子中的酚羥基及γ~吡喃酮環(huán)有關。

還原試驗

1.鹽酸-鎂粉(或鋅粉)反應 這是鑒定黃酮類化合物最常用的顏色反應。方法是將樣品溶于 1.0 ml甲醇或乙醇中，加入少許鎂粉(或鋅粉)振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1~2 min內(nèi)(必要時微熱)即可顯色。多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅至紫紅色。少數(shù)顯紫至藍色，當B環(huán)上有-OH或-OCH3取代時，呈現(xiàn)的顏色隨之加深。但查耳酮、橙酮、兒茶素類則無該顯色反應。異黃酮類除少數(shù)例外，也不顯色。

由于花青素及部分橙酮、查耳酮等在單純濃鹽酸中也會發(fā)生色變，故須預先作空白對照實驗(在供試液中僅加入濃鹽酸進行觀察)。

另外，在用植物粗提取液進行預試時，為了避免提取液本身顏色的干擾，可注意觀察加入濃鹽酸后升起的泡沫顏色。如泡沫為紅色，即示陽性。

鹽酸-鎂粉反應的機理過去解釋為由于生成了花色苷元所致，現(xiàn)在認為是因為生成了陽碳離子緣故。

2.四氫硼鈉(鉀)反應NaBH4是對二氫黃酮類化合物專屬性較高的一種還原劑。

與二氫黃酮類化合物產(chǎn)生紅至紫色。其他黃酮類化合物均不顯色，可與之區(qū)別。方法是在試管中加入0.1ml含有樣品的乙醇液，再加等量 2% NaBH4的甲醇液，lmin后，加濃鹽酸或濃硫酸數(shù)滴，生成紫色至紫紅色。

另外，近來報道二氫黃酮可與磷鉬酸試劑反應呈現(xiàn)棕褐色，也可作為二氫黃酮類化合物的特征鑒別反應。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類重要的天然有機化合物。其不同的顏色為天然色素家族添加了更多的色彩。這類含有氧雜環(huán)的化合物多存在于高等植物及羊齒類植物中。苔類中含有的黃酮類化合物為數(shù)不多，而藻類、微生物、細菌中沒有發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物。黃酮類化合物的存在形式既有與糖結(jié)合成苷的，也有游離體。

黃酮類化合物如此廣泛分布于植物界中，而且生理活性多種多樣，據(jù)不完全統(tǒng)計，其主要生理活性表現(xiàn)在:①對心血管系統(tǒng)的作用。②抗肝臟毒作用。③抗炎作用。④雌性激素樣作用。⑤抗菌及抗病毒作用。③瀉下作用。①解痙作用等。因而引起了國內(nèi)外的廣泛重視，研究進展很快。僅截止到1974年，國內(nèi)外報道發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物共1674個(主要是天然黃酮類，也有少部分為合成品，其中苷元902個，苷722個)，并以黃酮醇類最多;約占總數(shù)的三分之一，其次為黃酮類，占總數(shù)的四分之一以上，其余則較少。至于雙黃酮類多局限分布于裸子植物，尤其松柏綱、銀杏綱和鳳尾綱等植物中。截止到1993年統(tǒng)計，黃酮類化合物總數(shù)已超過4000個。

黃酮類化合物中常含有下列結(jié)構(gòu)單元，故常可與鋁鹽、鉛鹽、諸鹽、鎂鹽等試劑反應，生成有色絡合物。

1.鋁鹽 常用試劑為 1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液。生成的絡合物多為黃色，并有熒光，可用于定性及定量分析。

2.鉛鹽 常用工%醋酸鉛及堿式醋酸鉛水溶液，可生成黃至紅色沉淀。

黃酮類化合物與鉛鹽生成沉淀的色澤，因羥基數(shù)目及位置不同而異。其中，醋酸鉛只能與分子中具有鄰二酚羥基或兼有3-羥基、4-酮基或5-羥基、4-酮基結(jié)構(gòu)的化合物反應生成沉淀。但堿式醋酸鉛的沉淀能力要大得多，一般酚類化合物均可與其發(fā)生沉淀，依此不僅可用于鑒定，也可用于提取及分離工作。

3.鋯鹽 多用2%二氯氧鋯甲醇溶液 黃酮類化合物分子中有游離的3-或5-羥基存在時，均可與該試劑反應生成黃色的鋯絡合物。但兩種鋯絡合物對酸的穩(wěn)定性不同。3-羥基，4-酮基絡合物的穩(wěn)定性比5-羥基，4-酮基絡合物的穩(wěn)定性強(僅二氫黃酮醇除外)故當反應液中接著加入枸椽酸后，5-羥基黃酮的黃色溶液顯著褪色，而3-羥基黃酮溶液仍呈鮮黃色(鋯-枸椽酸反應)。方法是取樣品 0.5~1.0 mg，用10.0 ml甲醇加熱溶解，加1.0ml2%二氯氧鋯( ZrOCl2)甲醇液，呈黃色后再加入2%枸椽酸甲醇溶液，觀察顏色變化。

上述反應也可在紙上進行，得到的鋯鹽絡合物多呈黃綠色，并帶熒光。

4.鎂鹽 常用醋酸鎂甲醇溶液為顯色劑，本反應可在紙上進行。試驗時在紙上滴加

一滴供試液，噴以醋酸鎂的甲醇溶液，加熱干燥，在紫外光燈下觀察。二氫黃酮、二氫黃酮醇類可顯天藍色熒光，若具有C3-OH，色澤更為明顯。而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃-橙黃-褐色。

5.氯化鍶(SrCl2)

在氨性甲醇溶液中，氯化鍶可與分子中具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物生成綠色至棕色乃至黑色沉淀。

具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物與SrCl2的反應試驗時，取約1.0 mg檢品置小試管中，加入1.0 ml甲醇使溶(必要時可在水浴上加熱)，加入3滴0.01 mol/L。氯化鋁的甲醇溶液，再加3滴已用氨蒸氣飽和的甲醇溶液，注意觀察有無沉淀生成。

6.三氯化鐵 三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑。多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基，故可產(chǎn)生陽性反應，但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時，才呈現(xiàn)明顯反應。

(三)硼酸顯色反應

當黃酮類化合物分子中有下列結(jié)構(gòu)時，在無機酸或有機酸存在條件下，可與硼酸反應，生成亮黃色。顯然，5-羥基黃酮及2-羥基查耳酮類結(jié)構(gòu)可以滿足上述要求，故可與其他類型區(qū)別。一般在草酸存在下顯黃色并具有綠色熒光，但在枸椽酸丙酮存在的條件下，則只顯黃色而無熒光。

在日光及紫外光下，通過紙斑反應，觀察樣品用堿性試劑處理后的顏色變化情況，對于鑒別黃酮類化合物有一定意義。其中，用氨蒸氣處理后呈現(xiàn)的顏色變化置空氣中隨即褪去，但經(jīng)碳酸鈉水溶液處理而呈現(xiàn)的顏色置空氣中卻不褪色。

此外，利用堿性試劑的反應還可幫助鑒別分子中某些結(jié)構(gòu)特征。例如:

(1)二氫黃酮類易在堿液中開環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應的異構(gòu)體-查耳酮類化合物，顯橙至黃色。

(2)黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?，因此可與其他黃酮類區(qū)別。

(3)黃酮類化合物當分子中有鄰二酚羥基取代或3，4'-二羥基取代時，在堿液中不穩(wěn)定，易被氧化，由黃色-深紅色-綠棕色沉淀。

紙色譜適合分離檢識各種類型黃酮類化合物，包括苷和苷元。雙向紙色譜能檢識植物粗提物中黃酮類化合物存在的最好方法之一。用雙向紙色譜分離檢識黃酮類化合物時，第一向通常用一種"醇性"展開劑，第二如t-BuOH─HOAc─H2O(3:1:1)等;向通常用一種"水性"展開劑，如2%~5%HOAc等。

檢識黃酮類化合物苷元，通常用"醇性"展開劑。檢識苷往往用"水性"展開劑。

薄層色譜法仍然是分離和檢出植物粗提物中黃酮類化合物的重要方法之一。一般采用吸附薄層，吸附劑大多用硅膠和聚酰胺。

硅膠薄層主要用于分離大多數(shù)苷元，也可用于分離苷。

聚酰胺薄層色譜用于分離含游離酚羥基的苷與苷元較好。由于聚酰胺對黃酮類化合物吸附能力較強，因此，展開劑需要較強的極性。在展開劑中大多含有醇、酸或水，或兼有兩者。

纖維素薄層色譜分離黃酮苷元的溶劑系統(tǒng)有苯-乙酸-水(125∶72∶3)或氯仿-乙酸-水(10∶9∶1)。經(jīng)典的溶劑系統(tǒng)即5%~40%乙酸、正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)等亦經(jīng)常用于分離黃酮類化合物。

黃酮類成分的色譜條件可分為正相色譜和反相色譜二類，正相色譜采用硅膠為固定相，親脂性溶劑為流動相，主要檢識親脂性較強的黃酮。也可采用氰基鍵合擔體為固定相。反相色譜多用C18鍵合柱為擔體，流動相常用甲醇-水或乙腈-水，或甲醇-乙腈-水，有時以一定pH的酸水或緩沖溶液代替水加入。