疏水作用色譜

疏水作用色譜保留機(jī)理與反相色譜基本相同，所不同的是其固定相的疏水性不如反相固定相強(qiáng)，多為低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。疏水作用色譜主要用于蛋白質(zhì)的分離與純化。2100433B

疏水作用色譜法h川raphohir intert3}tion rhromato}raphy使用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，藉疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

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疏水作用提出

1959年，Kauzmann在《蛋白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展》上發(fā)表了一篇題為“影響蛋白質(zhì)變性的一些因素”的文章，首次明確提出“疏水作用”這一概念。在當(dāng)時(shí)，生物化學(xué)家已經(jīng)知曉蛋白質(zhì)中含有α螺旋和β折疊；一些蛋白質(zhì)和多肽的序列已經(jīng)測(cè)定；但是蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)還正在測(cè)定中。

疏水作用實(shí)驗(yàn)描述

與此同時(shí)，Tanford等為疏水作用的存在提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。從此以后，疏水作用的概念被蛋白質(zhì)化學(xué)家所接受。目前，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)20種氨基酸的疏水特性分別提出了不同的參數(shù)。對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)肽鏈中的每個(gè)氨基酸殘基也通常使用親/疏水作圖法(hydropathy)描述。通過(guò)親/疏水作圖法可以了解整條肽鏈中不同肽段的親/疏水性，進(jìn)而可以對(duì)一些處于蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇及一些膜蛋白中穿越膜的肽段進(jìn)行預(yù)測(cè)。

疏水作用色譜是利用樣品中各組分具有不同的疏水作用的性質(zhì)進(jìn)行分離，主要分離對(duì)象是蛋白質(zhì)。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動(dòng)相多采用高濃度鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強(qiáng)的疏水性和有機(jī)流動(dòng)相引起蛋白質(zhì)的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質(zhì)的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團(tuán)，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動(dòng)相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動(dòng)相中進(jìn)行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團(tuán)和固定相的疏水基團(tuán)作用而被保留。當(dāng)用流動(dòng)相洗脫時(shí)逐漸降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，洗脫能力增強(qiáng)。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開(kāi)。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來(lái)，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會(huì)失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動(dòng)相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過(guò)改變固定相的極性和流動(dòng)相的組成使蛋白質(zhì)得到分離。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過(guò)濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來(lái)分離復(fù)雜的生物樣品。該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段 。