疏水作用色譜

疏水作用色譜保留機理與反相色譜基本相同，所不同的是其固定相的疏水性不如反相固定相強，多為低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。疏水作用色譜主要用于蛋白質(zhì)的分離與純化。2100433B

疏水作用色譜法h川raphohir intert3}tion rhromato}raphy使用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動相，藉疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

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疏水作用提出

1959年，Kauzmann在《蛋白質(zhì)化學進展》上發(fā)表了一篇題為“影響蛋白質(zhì)變性的一些因素”的文章，首次明確提出“疏水作用”這一概念。在當時，生物化學家已經(jīng)知曉蛋白質(zhì)中含有α螺旋和β折疊；一些蛋白質(zhì)和多肽的序列已經(jīng)測定；但是蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)還正在測定中。

疏水作用實驗描述

與此同時，Tanford等為疏水作用的存在提供了實驗數(shù)據(jù)。從此以后，疏水作用的概念被蛋白質(zhì)化學家所接受。目前，不同實驗室對20種氨基酸的疏水特性分別提出了不同的參數(shù)。對一個蛋白質(zhì)肽鏈中的每個氨基酸殘基也通常使用親/疏水作圖法(hydropathy)描述。通過親/疏水作圖法可以了解整條肽鏈中不同肽段的親/疏水性，進而可以對一些處于蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇及一些膜蛋白中穿越膜的肽段進行預(yù)測。

疏水作用色譜是利用樣品中各組分具有不同的疏水作用的性質(zhì)進行分離，主要分離對象是蛋白質(zhì)。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動相多采用高濃度鹽緩沖液進行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強的疏水性和有機流動相引起蛋白質(zhì)的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質(zhì)的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動相中進行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團和固定相的疏水基團作用而被保留。當用流動相洗脫時逐漸降低流動相的離子強度，洗脫能力增強。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強弱，依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水作用由弱到強的組分分離開。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強烈作用，導致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動相的組成使蛋白質(zhì)得到分離。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段 。